柠檬酸含量检测试剂盒(Cr(Ⅵ)还原法)
【Boxbio】柠檬酸含量检测试剂盒(货号:AKAC003)
柠檬酸(CA)作为三羧酸循环第一步反应产物可参与光合作用、呼吸作用以及氨基酸、芳香物质、酯类和酚类物质的合成过程,其含量对于分析代谢过程具有重要意义,柠檬酸及其盐独特的分子结构使其具有各种优良的性质,可作为风味剂、稳定剂、抗氧化剂、抗血凝剂、缓蚀剂等,在食品加工、化妆品、畜牧业和医药领域具有广泛应用。
柠檬酸能够在酸性条件下将Cr6+还原为Cr3+,并生成柠檬酸铬螯合物,产物在545 nm处具有特征吸收峰,通过吸光值的变化即可定量检测柠檬酸的含量。
柠檬酸检测原理
测定过程中所需要的仪器和试剂:可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、可调式移液器、台式离心机、恒温水浴/培养箱和蒸馏水。
1.柠檬酸的提取(可根据预实验结果适当调整样本量及比例)
①液体样本:取0.1 mL液体样本加入0.9 mL试剂一充分混匀,4℃ 11000 g离心10 min,取上清液置于冰上待测。
②组织样本:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:(5-10)的比例(建议称取0.1 g组织,加入1 mL试剂一)处理样品,冰浴匀浆,4℃ 11000 g离心10 min,取上清液置于冰上待测。
③线粒体中柠檬酸的提取:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:(5-10)的比例(建议称取0.1 g组织,加入1 mL试剂一)处理样品,冰浴匀浆,4℃ 600 g离心5 min;取上清至新的离心管中,4℃ 11000 g离心10 min,弃上清(此上清液可用于细胞质CA含量测定);向沉淀中加入200 μL试剂二和2 μL试剂三,充分悬浮溶解,4℃ 11000 g离心10 min,取上清液置于冰上待测。
④细菌、真菌中柠檬酸的提取:离心收集细菌或细胞到离心管内,按照细菌或细胞数量(10个):试剂一体积(mL)为(500-1000):1的比例(建议500万细菌或细胞加入1 mL试剂一)处理样品,冰浴超声破碎细菌或细胞(功率300 W,超声3 s,间隔7 s,总时间3 min),4℃ 11000 g离心10 min,取上清液置于冰上待测。
吸光值测定:将反应液置于1 mL玻璃比色皿中,测定545 nm处吸光值,记为A测定,A标准和A空白,计算A测定=A测定-A空白,A标准=A标准-A空白。注:空白管只需测定1-2次。
标准曲线的建立:以4.0、3.0、2.0、1.0、0.5、0.25 mmol/L为横坐标(x),以其对应的A标准为纵坐标(y),绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将A测定带入公式中得到x(mmol/L)。
注意事项
①样本和待测样本均需置于冰上放置,柠檬酸提取过程需在冰上进行;
②若测定吸光值超出标准线性吸光值范围:大于最高值建议将待测样本适当稀释后再进行测定;小于最低值建议适当增加样本量重新提取后再进行测定,计算时相应修改;
③试剂五为易致癌物质,实验过程中需佩戴手套并做好防护,避免皮肤接触;
④柠檬酸提取液不能用于蛋白含量测定,如需测定蛋白含量,应另取组织进行测定;
⑤若显色30 min后出现明显黑色颗粒,属于正常现象,需将待测样本适当稀释后重新进行测定;
⑥为保证结果准确且避免试剂损失,测定前请仔细阅读说明书(以实际收到说明书内容为准),确认试剂储存和准备是否充分,操作步骤是否清楚,且务必取2-3个预期差异较大的样本进行预测定,过程中问题请您及时与工作人员联系。
For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.
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