支原体DNA提取试剂盒 简介及使用方法

　　支原体 DNA 提取试剂盒包含了分离 DNA 的试剂和组分。

　　从细胞培养物和生物药中提取支原体 DNA，和支原体检测试剂盒配套使用。 对支原体检 测能具有出色的灵敏度和高超的效率。它适用于广泛的样本类型。它遵循《欧洲药典》的检测标 准。

　　方法很简单，由四步组成：1）细胞裂解，2）DNA 吸附到核酸纯化柱上，3）去除残留污染 物和抑制剂，4）DNA 洗脱。此方法无须酚/氯仿抽提，只需 30 分钟即可完成制备，提供 PCR 所需的 DNA。

　　细胞培养基随着时间的延长，可能积聚抑制 PCR 的物质。已知血清含量大于 12%的培养基 对下游操作（例如 PCR）有抑制作用。而且，培养基中的酚红，对 qPCR 的荧光检测也有交叉 作用，产生假阳性。这些弊端可通过支原体 DNA 提取试剂盒来克服。

　　支原体 DNA 提取试剂盒可从最多含有 1X 106细胞/ml 的细胞上清中直接分离 DNA。

　　通常，细胞培养物应尽快进行 DNA 抽提。它也可取最多 500μl，在 95℃加热 10 分钟以使 之稳定，继而在室温可放 1 周。

　　富含蛋白的样本（蛋白含量＞10mg/ml）可能需要蛋白酶 K 处理后，再抽提 DNA（请参照 后面的流程）。

　　注意，此试剂盒不适于提取真核细胞组织的 DNA。 所有样本应认为有潜在的传染性，操作时应加小心。

　　应穿实验服和戴一次性手套。包含“吸附缓冲液”和“缓冲液 A1”的废弃物，可能与漂白 剂形成高活性化合物。所以不要向这些废弃物中加入漂白剂或酸性溶液。假如有溶液溢出，应使 用适合的实验室去污剂和清水冲洗。

　　吸附缓冲液包含有异丙醇和聚乙二醇辛基苯酚醚：易燃、有害和有刺激性。缓冲液 A1 包含 有硫氰酸胍：有害和有刺激性。

　　根据欧盟指引 1907/2006/EC（REACH 法规），有害标识列出如下

　　操作流程——详细步骤：

　　第一次使用前，向缓冲液 A1 和缓冲液 A2 加入无水乙醇。 将恒温仪设置到 70℃。使缓冲液 E 加热到 70℃。

　　1、向 1.5ml 新 EP 管中加入最多 200μl 细胞培养物。 对于即将上市产品的检测：向样品中最多加入 50μl 内控 DNA 对照。例如，使用 VenorGeM Classic Kit 时，向每个样品加入 30μl 内控 DNA；使用 VenorGeM qEP Kit 时，向每个样品加 入 12μl 内控 DNA。

　　2、加入 200μl 调节液，涡旋振荡至少 10 秒钟，在 70℃孵育 10 分钟。我们推荐使用恒温震荡 器，对样品进行持续晃动。或者在孵育过程中，对样品进行涡旋振荡 3~4 次。室温下静置 2 分 钟，再进入到第 3 步。 可选：如果蛋白含量＞10mg/ml，每个样品加入 10μl 蛋白酶 K。简单涡旋振荡，并按上述 描述进行孵育。

　　3、样本离心，向裂解物中加入 400μl 吸附缓冲液，立即涡旋振荡，充分混匀，防止核酸出现沉 淀。不要离心样本，立即进入下一步。

　　4、用移液器将裂解物吸到收集管中的核酸纯化柱中，不要将柱子的边缘弄湿。

　　5、将核酸纯化柱离心≥10000 ×g，1 分钟。弃掉收集管中的液体。重新将核酸纯化柱插到收 集管中。

　　6、加入 500μl 缓冲液 A1。离心核酸纯化柱≥10000 ×g，1 分钟。弃掉收集管中的液体。重新 将核酸纯化柱插到收集管中。

　　7、加入 500μl 缓冲液 A2。离心核酸纯化柱≥10000 ×g，1 分钟。弃掉收集管中的液体。重新 将核酸纯化柱插到收集管中。 可选：用缓冲液 A2 再重复一次冲洗步骤。

　　8、最大速度离心 3 分钟，以去除残留的缓冲液 A2。

　　9、弃掉收集管。将核酸纯化柱插入到一个新的 1.5ml EP 管中。

　　10、吸取 60μl 已预热的缓冲液 E（70℃），直接加到核酸纯化柱硅胶膜的中心。硅胶膜表面应 全部覆盖上缓冲液 E。

　　11、室温孵育 2 分钟，然后离心 8000×g，2 分钟。

　　12、洗脱液中即包含 DNA，可直接用于 PCR。也可在 2~8℃保存 1 周。更长期保存应在-18℃ 以下。

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