《食品科学》：河北科技大学宁亚维教授等：超高效液相色谱-串联质谱法检测食品中腰果

　　近年来，食物过敏在世界范围内的发生率呈现上升趋势，食物过敏已成为仅次于微生物污染的第2大食品安全问题。据数据研究显示，食物过敏在成年人中的患病率约为5%，儿童由于自身的免疫系统尚未发育成熟，患病率约为8%。当患者接触过敏原时，典型的过敏症状包括呕吐、腹泻、呼吸困难以及皮肤表面出现荨麻疹等，但也有患者出现比较严重的过敏性休克等危及生命的症状。为了帮助过敏患者规避食品中的过敏原，同时监督食品标签准确性，开发食品过敏原高灵敏度检测方法十分重要。

　　

　　基于质谱技术在过敏原检测中准确、稳定且高效的优点，河北科技大学食品与生物学院的宁亚维等采用Easy-nLC 1000纳升液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（Easy-nLC 1000-Q-Exactive）筛选腰果过敏原特异性肽段，并通过超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱，拟建立基于特征肽段的腰果过敏原MRM模式检测方法，用于多种食品基质中腰果过敏原的快速筛查和定量检测。

　　1、腰果特征肽段的筛选

　　

　　特征肽段的选择是液相色谱-串联质谱法检测食品过敏原中的关键一步，为了保证检验方法的稳定性和准确性，筛选到的特征肽段需要满足以下几点：首先肽段的长度应在8～25 个氨基酸之间；其次肽段应不含错切和漏切的酶切位点，并且不含任何蛋白质修饰的位点。同时，筛选到的肽段要经过BLAST搜索验证肽段特异性，确保其为腰果特有肽段。目前已鉴定的腰果过敏原蛋白有3 种，分别为Ana o 1、Ana o 2和Ana o 3，其氨基酸序列如图1所示。为了能够全面的检测食品中的腰果过敏原，本研究基于上述肽段筛选原则，针对每种腰果过敏原均筛选了2 条肽段，其中，AFSWEILEAALK和YGQLFEAER肽段对应于Ana o 1，这是首次筛选出腰果Ana o 1的肽段；ADIYTPEVGR和GQVQVVDNFGNR肽段对应于Ana o 2；ELYETASELPR和QFEEQQR对应于Ana o 3。筛选到的6 条肽段长度适中，特异性好，不易于降解；同时不含蛋白质修饰位点，不易于在蒸煮、烧烤和辐照等加工过程中发生成环、氧化和交联等副反应，影响定性及定量检测结果；此外，所筛选的肽段经过BLAST搜索验证证实具有高度特异性。同时，为了进一步验证所筛选肽段是否只存在于腰果中，制备了花生、杏仁、核桃、芝麻、葵花籽、开心果和榛子等常见坚果的酶解样品验证腰果肽段特异性，结果显示，所筛选的6 条腰果肽段均只在腰果酶解样品中检测到，而其他坚果酶解样品均显示未检出，进一步验证了肽段特异性。

　　2、质谱参数及液相色谱条件的优化

　　

　　目标蛋白的定量检测依赖于MRM模式，该模式的显著优点是具有较高灵敏度和特异性，能够对复杂基质中的微量靶向蛋白进行准确鉴定。为了提高特征肽段的检测灵敏度和稳定性，本研究对液相色谱条件和MRM质谱参数进行优化。首先以全扫描模式确定各特征肽段的准确母离子数，分别对其母离子进行二级扫描，筛选响应值较高的子离子，每个肽段选择了3 个子离子，响应值高且更加稳定的子离子作为定量离子，另外2 个子离子用于辅助定性。进一步优化每个子离子的碰撞能量、碎裂电压等参数，得到的质谱参数优化结果如表1所示。

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　比较乙腈-水和0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸分别作为流动相时肽段的峰形，以AFSWEILEAALK肽段为例，当使用乙腈-水作为流动相时，有明显拖尾（图2A）；当流动相为0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸时肽段的峰形更佳，拖尾现象明显改善（图2B）。优化后6 条特征肽段的提取离子流图如图3所示。在相同浓度下的腰果酶解样品中，ADIYTPEVGR肽段的响应值最高。综合肽段的灵敏度以及稳定性，将ADIYTPEVGR作为腰果的定量肽段。

　　3、方法学验证

　　线性范围、LOD和LOQ结果

　　

　　如表2所示，所筛选的6 条特异性肽段中，AFSWEILEAALK、ADIYTPEVGR和ELYETASELPR三条肽段的灵敏度较高，在固体基质中的LOD和LOQ分别为1 mg/kg和2.5 mg/kg；饮料基质中的LOD和LOQ分别为0.002 mg/mL和0.005 mg/mL。YGQLFEAER、GQVQVVDNFGNR和QFEEQQR三条肽段灵敏度较低，在固体基质中的LOD和LOQ分别为2 mg/kg和5 mg/kg；在饮料基质中的LOD和LOQ为0.005 mg/mL和0.01 mg/mL。筛选的6 条腰果肽段在饼干、面包、蛋糕、桃酥、巧克力和饮料6 种基质中的线性良好，标准曲线的相关性系数均大于0.99。腰果的LOQ为2.5 mg/kg，说明本研究方法具有较高的灵敏度。另外本方法选取ADIYTPEVGR肽段作为定量肽段，AFSWEILEAALK、YGQLFEAER、GQVQVVDNFGNR、ELYETASELPR、QFEEQQR肽段用于辅助定性，能够更准确地检测食品中腰果过敏原，避免腰果成分误检和漏检。

　　加标回收率结果

　　

　　

　　为了对方法的准确性和重复性进行验证，向空白基质中添加腰果标准储备液进行回收率的测定，结果如表3、4所示，6 条腰果特征肽段在饼干、面包、蛋糕、桃酥、巧克力和饮料6 种食品基质中的加标回收率为82.5%～109.9%，相对标准偏差（RSD）为0.9%～8.9%，均小于12%。证明此方法具有较高的可重复性和稳定性，可以用于不同食品基质中腰果过敏原成分测定。

　　基质效应

　　

　　食品基质可能对肽段检测产生干扰影响检测准确性，因此测定3 个肽段在6 种基质中的基质效应，结果显示（表5）：饼干、面包、蛋糕、桃酥和饮料5 种基质的基质效应均大于100%，说明这5 种基质对腰果肽段的检测具有增益作用，巧克力基质的基质效应小于100%，说明巧克力对腰果肽段的检测具有抑制作用，原因可能为巧克力中较为复杂的单宁和鞣酸等成分对肽段的离子化产生了影响。因此，本方法采用基质配标以补偿基质效应。

　　实际样品检测

　　

　　

　　结果表明（表6），36 个样品中共7 个样品检出腰果过敏原，检出率为19.4%，样品包括1 个面包样品、1 个蛋糕样品、1 个桃酥样品和4 个饮料样品。此外，将检测结果与食品标签的标注信息进行对比发现：23 个标注不含坚果成分的食品，检测结果全部为未检出；而11 个标注可能含坚果成分的样品中，有5 个样品检出了腰果成分；另外，配料表中标注含有腰果，但未以过敏原形式标注的2 个饮料样品，也检出了腰果成分。上述结果表明该方法不仅可用于食品标签中腰果成分标注情况的检验，还可用于食品中隐性腰果过敏原的筛查。

　　结论

　　建立食品中腰果过敏原的超高效液相色谱-串联质谱快速检测方法。通过蛋白质组学与高分辨质谱相结合，筛选到了6 条腰果特异性肽段，并采用三重四极杆质谱的MRM模式对食品中腰果过敏原进行定量，从而实现腰果过敏原的快速检测。该方法可以为我国食品标签真实性检验以及食品中隐性过敏原检验提供技术支持。

　　通信作者简介

　　

　　宁亚维，博士，教授，硕士生导师，河北科技大学食品与生物学院食品系主任。入选河北省青年拔尖人才，河北省三三三人才工程。2013年硕博连读毕业于江南大学食品科学专业，2011-2012年由国家公派到美国克莱姆森大学博士联合培养1年。2013年-至今工作于河北科技大学。目前担任国家自然基金项目函评专家，河北省食品学会青年工作委员会副主任。

　　长期从事生物源功能性食品配料与添加剂、益生菌资源挖掘、食品安全控制领域相关工作。主持国家自然科学基金、河北省自然科学基金、河北省重点研发计划、河北省青年拔尖人才项目等课题10余项；发表SCI/EI论文30余篇，其中第一作者发表SCI一区论文7篇；申请国家发明专利10余项。

　　本文《超高效液相色谱-串联质谱法检测食品中腰果过敏原》来源于《食品科学》2023年44卷4期329-336页，作者：宁亚维，杨正，马俊美，刘茁，陈佳，李强。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220411-119。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

　　图片来源于文章原文及摄图网。

　　

　　为构建多元化食物供给体系并兼顾生态环境保护，并形成以生物多样性保护促进食品生产的可持续性，北京食品科学研究院和中国食品杂志社将与北方民族大学、皖西学院、宿州学院、滁州学院于 2023年5月13-14日在中国宁夏银川 共同举办“ 生态保护与食品可持续发展国际研讨会 ”。本届研讨会将围绕新资源食品挖掘、动植物、微生物可替代蛋白、食用菌等食物资源的开发现状、重要创新进展及存在的问题开展研讨，探讨未来食品发展方向，通过展示我国生态保护与食品可持续发展等领域的最新科研成果，搭建科研单位与企业产学研结合的平台，共同促进我国食品产业发展快速踏入新里程。

　　

　　

　　Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。

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