北化谭天伟等：微生物制造绿色化学品研究进展｜综述

　　

　　毕浩然 张洋 王凯 徐晨晨 霍奕影 陈必强 谭天伟

　　（北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029）

　　DOI：10.11949/0438-1157.20221322

　　摘 要 微生物制造利用生物质和二氧化碳等可再生原料进行化学品的绿色生产，显示出了巨大的二氧化碳减排潜力，是促进实现“碳中和”目标的重要途径，其核心内容之一是高效微生物细胞工厂的设计与构建。综述了基于基因组规模代谢网络模型的代谢流分析和代谢途径预测研究进展；介绍了新型基因组编辑工具助力微生物细胞工厂的高效开发；总结了代谢调控策略用于提升细胞工厂生产能力。此外，还概述了微生物制造关键技术在第三代生物制造中的应用。最后，展望了未来微生物制造在化学品生产中的应用和发展方向。关键词 微生物制造；代谢网络模型；基因组编辑；代谢调控；微生物利用

　　生物制造使用生物质、CO2等可再生资源作为原料，通过生物工艺路线进行各类化学品合成，长期以来一直被视为取代不可持续的化石经济的绿色生产模式[1]。设计并建立高效的化学品生物合成路线是绿色生物制造的重要目标。微生物制造是绿色生物制造的重要研究内容，其核心是微生物细胞工厂的设计与开发。随着对可持续和环境友好的生物制造需求的不断增加，利用合成生物学技术合成化学品受到越来越多的关注。伴随着合成生物学和代谢工程的发展，已有多项研究通过合理设计微生物细胞工厂实现生物燃料、天然化合物、医药化学品、大宗化学品等诸多产品的高效生产（表1），这些研究成果展示出了微生物制造的巨大潜力。表1 微生物制造各类化学品

　　

　　基因工程、代谢工程、分子生物学和计算机科学等学科是微生物制造和微生物细胞工厂开发的学科基础，其相应技术（如代谢网络模型分析技术、基因编辑技术和代谢调控技术）的发展与应用也推动了生物制造领域的进步。

　　目前，代谢网络重建已成为系统生物学领域探索细胞代谢的重要工具[21]。基因组规模代谢网络模型（genome-scale metabolic network model, GSMM）已经被开发出来，并被用于指导系统代谢工程战略的菌种设计和开发[22]。新型基因组编辑技术的发展大大缩短了工业菌株开发迭代的周期，同时使得研究人员可以更精确地进行微生物细胞工厂的创制与改进。由于微生物自身代谢网络和产物合成途径的复杂性，高效微生物细胞工厂的构建还需要从物质、能量和细胞生理生化等多层面进行研究[23]。一方面，产品的合成需要合成前体、能量和辅因子的充足供给；另一方面，通过对各种调控元件进行研究可以实现人工调节细胞内的碳代谢流向和分配，减轻细胞代谢负担，改善细胞生长并提升产物合成效率（图1）。

　　图1 高效微生物细胞工厂构建的主要策略随着生物制造领域的发展，生物制造的原料逐渐由第一代的淀粉和油脂向第二代非粮生物质原料，如木质纤维素等转变。生物制造的产品也由生物燃料扩展至生物基材料和生物基化学品等。随着石油枯竭和气候变化的加速，构建将基于CO2的可再生原料转化为化学品和生物燃料的工程微生物细胞工厂已成为实现“碳中和”生物制造的潜在途径之一，即第三代（3G）生物制造。与第一代和第二代生物制造相比，第三代生物制造具有低原料加工成本和可吸收消耗温室气体的优势。第三代生物制造中的主要挑战是提升自养微生物中的碳固定效率，以及优化微生物中能源利用和产物合成的效率。

　　对此，本文首先总结了微生物细胞工厂设计开发关键技术的最新发展，并对其在微生物制造，尤其是第三代生物制造领域中的应用进行介绍。

　　传统的微生物细胞工厂设计与改造往往依赖于研究人员的研发经验或菌株诱变与适应性进化技术，微生物自身的复杂性可能会使得这一研发过程效率低下且存在不可控性。计算工具的出现为合成生物学提供了强大的理论指导，基于全基因组的代谢网络研究已逐渐成为合成生物学的重要组成部分。当前已经建立的基因组水平的代谢网络模型的物种包括大肠杆菌、酿酒酵母、谷氨酸棒杆菌、肺炎克雷伯菌等[24-27]。

　　利用不同物种的基因组规模代谢网络模型预测生长速度、基因的必要性、目标代谢物的代谢表型从而为实验进行理性指导。基于基因组规模代谢网络模型的代谢流分析算法是实现代谢流分析与预测的关键。新算法的开发为实现更准确的代谢流计算奠定基础。此外，代谢网络模型及算法的整合，并结合基因组、蛋白组及代谢组学分析，挖掘代谢途径相关数据，建立代谢流分析数据库，构建代谢流分析软件平台，实现了高效、准确及多元化的代谢途径预测，助力合成生物学发展。

　　基因组规模代谢网络模型是一种特殊的代谢模型，它是通过对特定生物的基因组信息进行解析并重建的包含该生物中所有己知生化反应的代谢网络，代谢网络模型是表示一个细胞内的基因、酶、反应、代谢物以及它们之间关系的矩阵和映射[28]。

　　代谢网络模型重建已成为合成生物学研究中一个不可或缺的部分。在2010年之前，重构的代谢网络质量参差不齐，这是由于目标生物的可用数据量不同，以及缺少详细描述网络重建过程的标准操作流程。2010年，Thiele等[29]发表了基因组规模代谢网络模型重构的标准化详细流程，总共96个步骤，为代谢网络模型重构提供了标准操作程序。截至目前，在微生物中 (细菌、古菌和真核生物) 已有6000余种GSMM被构建出来[30]。

　　流平衡分析（flux balance analysis，FBA）是一种广泛用于研究生化反应网络的方法，该方法被用于构建基因组规模代谢网络模型[27, 31-32]。FBA通过代谢网络计算代谢流，从而使预测微生物的生长速率或者一种重要代谢产物的生产速率成为可能。随着越来越多种微生物的代谢网络模型被重构和使用，以及高通量技术的发展，使得重建模型的数量逐年增长，FBA逐渐成为了一种重要的分析工具[33]。FBA能够在基因组层面上预测模型中反应通量的大小[34]，具有较大的研究和应用价值[35]。

　　FBA算法是代谢优化算法中的基本算法[33]，该算法基于质量守恒原理和“拟稳态”假设，是面向代谢流的计算方法，可扩展性强。但是FBA算法约束条件较弱，预测准确率较低，以FBA算法为基础又发展出了许多优化算法。rFBA算法整合了转录调控信息，将表达谱数据转化成1和0表示的布尔量，能够解释、分析和预测转录调控在系统水平上对细胞代谢的影响[36]。通过进一步整合常微分方程，开发了iFBA算法，iFBA相较于 rFBA预测更准确[37]。dFBA算法在FBA的基础上加入了对于动力学因素的考虑[38]，通过对大肠杆菌的代谢通量进行动态模拟预测了其在葡萄糖发酵条件下的二次生长现象，这对代谢网络模型的应用范围进行了拓展。cFBA又在之前基础上增加了反应化学计量数、热力学和生态系统等限制性条件，这使得研究者可以对微生物群体的代谢行为进行系统研究[39]。E-FLUX、GX-FBA和PROM依据表达量的不同设置了不同的反应速率上下限约束[40-42]。E-INIT算法将布尔形式确定的高表达量酶催化反应的代谢通量限定必须大于某个阈值[43]。E-iMAT将转录组学和蛋白质组学数据与基因组规模代谢网络模型集成在一起，以预测酶的代谢通量[44-45]。CEF和mCEF算法首先计算网络的基元模式，然后利用二次优化方法得到基元模式的线性组合[46-47]。通过添加动力学、热力学和反应化学计量数等约束条件并结合多组学分析数据，极大提升了模型预测的准确性。在预测出代谢途径后，进一步利用基因编辑工具对相关基因进行理性改造以获得不同表型的重组菌株，这有助于加速最优代谢通路的发掘以及非天然产物微生物合成途径的设计与构建。

　　除了代谢通路的预测与设计，关键基因表达强度的精确调控对于微生物中产物的高效合成同样至关重要。OptKnock算法是一种典型的基因敲除算法，通过分别对生物量方程和目标产物合成方程进行求解，筛选出能够提高目标产物通量的基因敲除靶点作为后续菌株开发的改造依据[48]。在此基础上进行优化，ReacKnock算法能够实现多基因靶点的预测[49]。其他几类算法如OptSwap算法可以用于微生物辅因子调控策略的预测与设计[50]；OptForce算法可以比较实验菌株与野生型菌株之间的代谢通量差异来预测途径通量上调或下调的靶点[51]；k-OptForce算法在OptForce算法基础上加入了酶动力学常数的约束，提升了预测的准确度[52]。GECKO将酶约束引入酿酒酵母代谢网络模型中，该模型可以考察代谢途径之间和之内的酶分布[53]。OptMDFpathway算法扩展了最近提出的用于热力学路径分析的最大-最小驱动力框架（MDF），能够识别具有最大热力学驱动力的代谢途径，并将其用于分析大肠杆菌的内源性CO2固定潜力[54]。上述的优化算法大多数都专注于单一代谢干预策略，OptDesign算法是一种新的两步菌株设计策略。在第一步中，OptDesign筛选出在野生型和生产菌株之间具有明显通量差异的候选代谢反应；在第二步中，通过有限的操作计算最优设计策略，从而实现目标化合物的高产[55]。

　　上述代谢优化算法旨在进一步优化已有代谢通路，并为提升产物合成效率发掘有效改造靶点。利用基因组代谢网络模型并配合多种代谢优化算法，可以同时实现合成途径的设计与优化，为工业菌株的创制与改进提供有力参考。为了使预测的准确度和可行性更高，研究者们正努力开发更完善的优化算法以满足合成生物学发展的需求，具有代表性的优化算法总结于表2中。表2 优化算法总结

　　

　　目前已经有一些成功的案例利用相关菌株的基因组规模代谢网络模型和上述的一些优化算法进行模拟预测并指导实验，获得较好的结果，为代谢工程改造提供了理论指导。SimOptStrain算法同时考虑宿主生物体中的基因删除和引入数据库（如KEGG或MetaCyc）中外源基因的影响，利用该算法预测得到了基因敲除靶点sdhC、gnd和glyA，并引入由2-酮戊二酸脱氢酶催化的反应，使得琥珀酸产量达到最大理论产量的32.5%[57]。借助OptSwap进行辅因子相关改造策略的预测，识别获得谷氨酸脱氢酶为辅因子偏好性的改造靶点，用外源NADP+依赖的谷氨酸脱氢酶替换解脂耶氏酵母内源NAD+依赖的谷氨酸脱氢酶促进了油脂合成[58]。

　　利用OptForce算法对代谢模型中的反应进行分类，从而确定所有可能的工程干预策略。通过该算法对谷氨酸棒杆菌基因组规模代谢网络模型iCW773进行透明质酸生物合成途径的通量平衡分析，确定了包括合成途径强化、糖酵解途径减弱、磷酸戊糖途径基因敲除和丙酮酸脱氢酶活性减弱在内的一系列改造策略，获得的工程菌株在5 L发酵罐的分批补料培养中获得28.7 g/L的透明质酸[59]。

　　除此之外，利用GSMM进行多目标靶点预测和组合以指导代谢工程改造也已成功应用于有机酸、氨基酸和醇类的生产。这表明GSMM与实验的结合可以指导菌株的理性设计，通过在全局水平上考虑遗传改造对整个微生物代谢的影响从而实现对代谢通量的精确调节，加快微生物细胞工厂的开发效率。

　　传统的基因编辑技术包括Red同源重组技术、锌指核酸酶技术（zinc-finger nuculeases，ZEN）、转录激活因子效应物核酸酶技术（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）和Cre/loxP重组酶系统等[60-64]。随着微生物制造领域的发展，上述基因编辑技术因存在试验周期长、成本高等缺点，逐渐无法满足工业生产菌株高效研制的需求。

　　近年来，CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins）系统因其具有设计和操作简便、准确性高、菌株通用性强等优势而备受关注。除了基本的染色体基因敲入和敲除之外，基于CRISPR系统的新型基因编辑技术也被应用于染色体上的单碱基定点突变以及全基因组规模的多基因突变。此外，新型基因组编辑技术的开发也使得大片段和多片段的基因组整合效率得到提升，大幅缩短了工程菌株的构建周期。

　　CRISPR/Cas系统是原核生物中应对噬菌体等侵入性DNA的天然免疫系统，该系统已被开发成为在原核和真核细胞中进行基因组编辑和转录调节的强大工具[65-66]。核酸内切酶可以在sgRNA（small guide RNA）的引导下在染色体的特定位点产生可致死的DNA双链断裂（double strand break, DSB）。在细胞修复DSB的过程中会发生基因组修饰，主要有两种方式，即非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ）和同源重组（homologous recombination, HR）[67]。其中NHEJ可能会在基因组断裂位点处引入不可预知的碱基插入或缺失，相比之下HR可以利用特定的同源DNA模板精确地进行染色体修复。

　　目前已经开发出了多种微生物宿主的CRISPR基因编辑工具。在解脂耶氏酵母中开发的标准化CRISPR基因编辑工具利用一个同源供体质粒和一个CRISPR/Cas9表达质粒实现了基因组的无痕靶向整合，并借助此构建了番茄红素合成途径[68]。

　　Holkenbrink等[69]开发出了EasyCloneYALI基因编辑工具箱，该工具箱通过CRISPR/Cas9系统在解酯耶氏酵母中实现高效基因组编辑效率达到80%以上，这项研究还在解脂耶氏酵母染色体上确定了11个基因间中性整合位点，并评估了12个启动子的相容性。在大肠杆菌中开发了基于CRISPR/Cas9系统的多途径优化技术（CRISPR/Cas9-facilitated multiplex pathway optimization, CFPO），通过构建供体DNA质粒库替代靶基因的核糖体结合位点实现组合表达优化。利用这套工具同时微调大肠杆菌天然木糖利用途径中四个基因的表达强度，使得木糖利用率提高了3倍[70]。在酿酒酵母中使用基于CRISPR系统的多重基因组编辑工具，只需经过两轮实验就可以实现酵母脂质合成途径中八个相关基因的敲除，在10 d内使游离脂肪酸产量提升了30倍[71]。

　　Yang等[72-73]发现了一种高活性的CRISPR相关转座酶（CAST），并将其部署为多重染色体整合工具（multiple chromosomal integration by CRISPR-associated transposases, MUCICAT）。通过将这一工具应用于重组蛋白表达量优化与多条代谢途径同时阻断，使得大肠杆菌细胞工厂的创制速度得到了数量级的提升，MUCICAT的应用显著加速了新一代工程细胞的理性改造。

　　如上文所述，微生物细胞中的精确基因组编辑在很大程度上依赖于供体DNA的转化和HR整合外源DNA模板，而这两者可能会引起细胞存活率低或在多重整合时效率低下[74-75]。为了解决这一问题，近期碱基编辑技术已被开发并应用于微生物的基因组工程。碱基编辑结合了CRISPR/Cas系统的靶向特异性和核碱基脱氨酶的催化活性，在不引入DSB、不添加外源DNA以及不依赖HR的情况下在染色体特定位点实现定点突变[76]。

　　到目前为止已经开发出了两类DNA碱基编辑器，即胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editor, CBE），将C∶G碱基转变为T∶A碱基[77-78]；及腺嘌呤碱基编辑器（adenine base editor, ABE），将A∶T碱基转变为G∶C碱基[79]。基因组碱基编辑工具具有简便性、高效性和多重编辑能力，最近已应用于各种原核和真核微生物的染色体编辑工作中。在大肠杆菌中利用CBE工具和4个靶向序列，同时编辑了多拷贝（41个位点）转座酶基因[80]。此外，在大肠杆菌中通过进化腺苷脱氨酶（TadA)以利用ABE工具进行基因组高效碱基编辑[79]。

　　在微生物细胞工厂构建过程中可能会需要通过全基因组工程在基因组中产生序列改变，进而产生菌株突变文库以实现微生物细胞工厂的高通量筛选[67]。CRISPR适用性的可追踪基因组工程策略（CRISPR-enabled trackable genome engineering, CREATE）已经被开发出来，使用DNA芯片合成了包含编辑盒的文库并克隆到编辑质粒中，这些编辑盒可以作为条形码来跟踪基因组修饰[81]。进一步地，利用此项技术在大肠杆菌中构建了菌株文库，其中包含来自异丙醇合成途径中四个基因的四个不同RBS水平的256个总变体，经过筛选异丙醇产量提高了1.5倍[82]。使用类似的策略，研究人员在大肠杆菌中构建和筛选了3-羟基丙酸合成途径，并使得其产量提升了60倍[83]；在酿酒酵母中，通过构建突变文库提高了菌株的葡萄糖、乙醇耐受性，并使得乙醇浓度提高2倍[84]。

　　化学诱导染色体进化技术（chemically inducible chromosomal evolution, CIChE）使用大肠杆菌recA同源重组来增加基因的拷贝数。在添加抗生素条件下，具有高目标基因拷贝数的菌株将存活并被挑选出用于下一轮编辑改造，在抗生素压力下，利用这一技术可以持续增加基因拷贝数，最终筛选出具有理想表型的菌株[85]。

　　在酿酒酵母中开发了一种快速基因组重排技术（synthetic chromosome rearrangement and modification by loxP-mediated evolution, SCRaMbLE），这一重排技术通过Cre重组酶介导的两个相邻loxPsym位点之间的重组来实现[86]。SCRaMbLE技术可以在酵母基因组中产生大量突变进而获得菌株文库，利用该技术提高了酵母中胡萝卜素和紫罗兰素的产量[87]。类似地，利用SCRaMbLE技术还提升了酵母的菌株耐受性[88]。

　　与酿酒酵母相比，解脂耶氏酵母基于同源重组进行大片段的整合难度更大，通常采用敲除Ku70、Ku80和MEF1等NHEJ相关的基因来提高HR的效率[89]。解脂耶氏酵母接受外源DNA的能力很强，研究表明多个长DNA片段可以随机且有效地以NHEJ的方式整合到解脂耶氏酵母的基因组中。与需要使用长同源臂序列靶向和菌落PCR验证筛选阳性克隆的HR介导的整合不同，多个长DNA片段可以通过NHEJ快速高效地整合至基因组上，这大大降低了菌株构建难度、缩短了改造周期[90]。在解脂耶氏酵母中通过NHEJ将Leu2基因随机插入至亮氨酸缺陷菌株中以构建突变文库，配合流式细胞术进行高通量筛选，最终获得了多个有效改造靶点和高产β-胡萝卜素菌株[91]。

　　利用微生物高效合成化学品依赖于合成前体物的充足供给，本文以乙酰辅酶A为例介绍其衍生产品的研究进展。乙酰辅酶A是碳水化合物、脂质和氨基酸分解代谢产生的关键代谢中间体，乙酰辅酶A代谢主要发生在真核微生物的细胞核、线粒体、细胞质和过氧化物酶体中[92]。乙酰辅酶A的生物合成和代谢过程涉及过氧化物酶体、细胞质、线粒体和细胞核中的诸多代谢反应，为各种生理生化反应和维持细胞生长提供碳和能量[93]。乙酰辅酶A可以用于生物合成多种化合物，如萜类化合物、脂肪酸和脂肪酸衍生化合物、类黄酮、芪类和聚酮化合物[94]。

　　乙酰辅酶A由乙酰基和辅酶A两部分组成，其中辅酶A的生物合成需要五种必需酶（CAB1~ CAB5）的参与[95]。辅酶A从结构上由半胱胺、4-磷酸泛酸和磷酸化AMP构成，这三者分别由半胱氨酸、泛酸和ATP生成。由于辅酶A是乙酰辅酶A生物合成的前体，因此调节辅酶A代谢是增加乙酰辅酶A供给的有效策略。ATP依赖泛酸激酶的过表达以及外源补充泛酸能够改善辅酶A的合成，并使(2S)-柚皮素的产量提高了两倍[95]。类似的策略使得大肠杆菌中辅酶A和乙酰辅酶A的合成分别提高了10倍和5倍[96]。为了解除反馈抑制，通过引入对反馈不敏感的泛酸激酶和泛酸-磷酸腺苷酸转移酶突变体，使乙酰辅酶A增加了2.75倍[97]。这些研究表明泛酸和泛酸激酶是提高胞内辅酶A和乙酰辅酶A水平的关键因素。

　　线粒体中有高浓度的乙酰辅酶A，但线粒体中的乙酰辅酶A无法直接跨过线粒体膜转运到胞质中。为了增强对线粒体中乙酰辅酶A的利用，需要将产物合成途径定位至线粒体中或将乙酰辅酶A由线粒体转出。线粒体中的生物合成受到空间的限制，而且线粒体中缺少氧化还原电位、辅因子等产物合成所需底物。考虑到上述因素，提高胞质中乙酰辅酶A水平可能对于乙酰辅酶A衍生产品的合成更为有利。乙酰辅酶A可以通过线粒体柠檬-α-酮戊二酸转运蛋白（Yhm2）在酿酒酵母和解脂耶氏酵母中以柠檬酸的形式从线粒体中转运到胞质，胞质中的柠檬酸可以被ATP柠檬酸裂解酶再生为乙酰辅酶A[98-99]。通过阻断胞内某些乙酰辅酶A消耗途径同样可以促进乙酰辅酶A积累，通过敲除乙醛酸循环中的苹果酸合酶和过氧化物酶体柠檬酸合酶使得α-檀香烯的产量分别提高了1.36倍和2.27倍[100]。

　　微生物需要ATP和还原力以运行复杂的生理功能，如底物吸收、细胞生长、产物合成、代谢物输出和压力耐受[101]。当微生物细胞工厂进行高强度的产物合成（尤其是耗能途径）并面临严重的外界环境压力时，细胞中的能量稳态经常被破坏。细胞很难通过自身的调节系统来补偿对能量的需求。目前微生物中能量稳态策略侧重于加强能量的供应和减少能量的消耗。

　　细胞内的能量代谢可以通过改善底物水平的磷酸化、增加NADH供应、操纵电子传递链（electron transfer chain, ETC）和强化ATP合酶来优化。细胞底物水平的磷酸化对于ATP的合成至关重要[102]。糖酵解是一种常见的底物水平磷酸化途径，每mol葡萄糖的净产量为2 mol ATP，甘油酸-3-磷酸激酶和丙酮酸激酶的过表达以及去磷酸化己糖激酶的微调通过糖酵解途径略微增加了细胞内ATP水平，并使得L-精氨酸产量和3-羟基丙酸产量分别提高了16.2%和7.6%[103-104]。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和乙酸激酶催化底物能够生成ATP，对其进行强化使得琥珀酸和乙醇产量分别提高60%和180%[105-106]。这表明提高底物水平的磷酸化是增强胞内能量供应的有效策略，因为与氧化磷酸化相比它能够更为高效地提供ATP。

　　增加NADH供应是增加胞内能量供应的有效策略，可溶性转氢酶UdhA在枯草芽孢杆菌中的过表达显著增加了细胞内NADH和ATP的供应，比细胞生长速率提高了83%，异丁醇产量提高了24%[107]。

　　胞内能量的再生主要指通过再生NAD(P)H和ATP以实现产物合成模块所需的能量的自给自足。通过表达天然转氢酶和丙二酰辅酶A还原酶来构建NAD(P)H再生系统提高了大肠杆菌中3-羟基丙酸的产量[108]。在大肠杆菌中构建了使用三聚磷酸盐作为磷酸基团供体的ATP再生系统，通过表达聚磷酸激酶PPK显著提升了谷胱甘肽和S-腺苷蛋氨酸的联产[109]。

　　在微生物细胞中构建能量节约途径，减少合成途径中ATP消耗。在大肠杆菌中构建节能途径来生产琥珀酸，这一策略使得胞内ATP含量增加338%，琥珀酸产量提高282%[110]。

　　在以往的微生物细胞工厂的构建过程中，为了增强产物合成途径或减少碳代谢的分流，往往会对目标基因（途径）进行过表达或对竞争途径进行阻断。然而，一些基因的敲除会对细胞生长产生不利影响，基因的过度表达也可能会给微生物带来代谢负担。因此，研究的重点在于如何在恰当的时间使用适当的代谢调控方法来调节基因表达水平。动态调控策略的应用已被证明是提升细胞工厂生产能力的有效途径。它非常类似于微生物中的天然调节机制，通过感知环境中和细胞内信号来实时调节细胞的代谢状态，从而在细胞中以更温和保守的方式进行碳和能量的分配[111]。

　　目前已经开发了多种基于代谢物响应的动态控制元件，实现了代谢网络中物质和能量流的动态分布，减少了异源途径对细胞生长和代谢流平衡的影响，有效地调节多种高附加值产物的高效合成。以丙二酰辅酶A作为信号分子构建动态双途径调控系统，低水平的葡萄糖会抑制脂肪酸合成酶的表达进而在胞内积累丙二酰辅酶A，而丙二酰辅酶A的积累则会使转录阻遏物失活并驱动3-羟基丙酸的合成，这种两级动态系统的引入最终使酿酒酵母中3-羟基丙酸产量提高10倍[112]。通过设计一种基于丙二酰辅酶A的负反馈调节系统，根据细胞需求调控丙二酰辅酶A合成以减少细胞能量浪费，这一策略使得脂肪酸产量提高34%[113]。丙酮酸是一种重要中心代谢物，在枯草芽孢杆菌中设计并构建了一套丙酮酸响应的遗传电路，实现了对糖酵解途径和磷酸戊糖途径的动态调控，这一策略使葡萄糖二酸产量提高154%[114]。

　　微生物发酵过程中的pH、温度、溶氧等可控参数可以用于切换细胞的生长和生产状态。利用温敏性启动子实现在不同温度下目标基因的激活与抑制，提高了大肠杆菌利用木质纤维素水解物合成乙醇的能力[115]。在大肠杆菌中使用氧气敏感型启动子调控D-乳酸、2,3-丁二醇和1,3-丙二醇三种产物的生物合成，通过控制溶氧水平进行细胞生长和产物合成的阶段切换，提升了生产能力[116]。

　　群体感应（quorum sensing, QS）是一种在细胞中信号分子随细胞密度积累进而激活或抑制特定基因表达的机制。LuxI-LuxR系统是应用最多的QS系统之一，利用该系统介导的调节器实现了大肠杆菌中红没药烯合成代谢状态的自主控制，使得红没药烯产量提升49%[117]。利用EsaI-EsaR系统介导的基因电路对磷酸果糖激酶和莽草酸激酶的表达进行控制，从而实现了产物合成途径与中枢代谢途径之间的碳通量平衡，该策略显著提升了工程菌株中肌醇、葡糖二酸和莽草酸的产量[118]。

　　通过设计和开发微生物细胞工厂将基于二氧化碳的原料转化为燃料和化学品，为第三代生物制造提供了一条可行的“碳中和”途径（表3）。之前已有综述文章对微生物中的二氧化碳固定途径进行了详细总结，其主要包括二羧酸/4-羟基丁酸（DC/HB）循环、Calvin-Benson-Bassham循环（CBB循环或卡尔文循环）、Wood-Ljungdahl途径（W-L途径，或还原性乙酰辅酶A途径）、3-羟基丙酸/4-羟基丁酸（HP/HB）循环、3-羟基丙酸（3-HP）双循环以及还原性TCA循环[132]。表3 利用CO2和C1原料生产化学品

　　

　　使用工程化的细菌Clostridium autoethanogenum在工业化发酵罐中进行连续发酵，其从废气原料中生产丙酮和异丙醇的生产速率达到3 g/（L·h）[124]。藻类是第三代生物制造的重要宿主，其可以通过固定二氧化碳合成碳水化合物和脂质，为生物可再生能源行业提供支持。小球藻（Chlamydomonas reinhardtii和Dunaliella salina）是一种生长迅速的藻类，其细胞脂质含量非常高（60%~70%），Chen等[119]报道了原壳小球藻Chlorella protothecoides的脂质生产强度高达7.4 g/（L·d）。微藻积累的生物质可以用于沼气和生物乙醇的生产，通过厌氧消化从微藻类生物质中生产沼气，通过糖类的水解和后续的微生物发酵生产生物乙醇和生物化学品[120]。除此之外，还可以利用微藻细胞通过光合作用的光解过程来生产和储存生物氢[121]。

　　为了更高效地实现基于CO2为原料的第三代生物制造，研究人员将整个过程分为碳固定过程和化学品转化过程，首先通过微生物自养合成短链化学物质，然后利用微生物细胞工厂将其转化为化学品。例如，产乙酸菌可以从合成气中生产乙酸[125]。合成气衍生的乙酸可以被用作合成多种化学品的原料，如微生物脂质、苹果酸和聚羟基链烷酸酯（PHA）等[126-128]。电催化和生物催化的结合将使CO2生产多种化学品成为可能[133]，利用固体电解质反应器和纳米结构铜催化剂稳定催化二氧化碳还原生产乙酸，然后作为微生物的发酵碳源在工程酿酒酵母中生产葡萄糖和脂肪酸[129]。

　　甲醇是一种十分重要的基础化工原料和清洁能源，具有来源广泛和价格低廉的优点。毕赤酵母可以以甲醇作为唯一碳源进行生长。在最近的一项研究中，通过引入甲醇同化途径、单磷酸木糖（XuMP）循环将毕赤酵母转变为以CO2为碳源、以甲醇为能量源的自养菌株[134]。为了能使酿酒酵母直接利用甲醇，研究人员在酿酒酵母中重建了来自毕赤酵母的XuMP循环，重组菌株可以在消耗1.04 g/L甲醇的同时产生0.26 g/L丙酮酸[131]。

　　在酿酒酵母中表达来自卡尔文循环的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶（RuBisCO）和磷酸核糖激酶（PRK）增加了由葡萄糖和木糖生产乙醇的产量[135-136]。最近的研究发现，二氧化碳可以通过电化学方法高效地转化为甲酸[137]。在酿酒酵母中表达还原甘氨酸途径实现了由木糖和甲酸合成甘氨酸，这表明甲酸可以作为酿酒酵母的碳源，这些研究成果证明了酿酒酵母作为第三代生物制造工厂进行化学品生产的可行性[138]。

　　目前生物制造的发展方向在于如何将底物充分利用以及加速推进生产原料由淀粉、油脂到木质纤维素再到基于CO2的C1底物的转变。利用第三代生物制造技术构建微生物细胞工厂将CO2和C1底物转化为化学品和燃料，通过资源的闭环回收实现负碳减排。然而，目前微生物对CO2的利用效率仍然较低，限制了其大规模应用。以CO2为原料的生物制造的未来研究方向可能包括：利用计算机模拟设计出有效的CO2固定化酶和固定途径，提升产物合成效率并降低生产成本；积累目前利用CO2生物体的基因组、转录组、蛋白质组和代谢组数据，优化CO2捕获技术；加速工业菌株的开发和迭代速率，将CO2衍生产品种类由燃料和化学品拓宽至材料、医药、食品等多领域，充分释放其生产潜力。

　　微生物制造领域仍处于飞速发展阶段，随着生物技术的革新和微生物细胞工厂的开发，在不久的将来，将有更多的燃料和各类化学品通过微生物细胞工厂进行绿色生产并创造出更大的经济和社会价值。微生物制造这一绿色制造模式将极大推动我国传统产业的转型升级并对我国走新型工业化道路具有重要战略意义。考虑到全球局势，如未来的食品和饲料需求、气候变化和主要产油国的政治因素，通过第三代生物制造进行大规模燃料、食品和可再生化学品生产能够减少对石油产品的依赖，推动可持续经济社会的建设和发展，促进“碳中和”目标的实现。

　　来源：化工学报

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