复方1区-北京中医大：血清化学＼肠菌＼代谢组学揭示茵栀黄颗粒改善NAFLD的物质

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　　导读

　　茵栀黄颗粒（YZHG）具有保肝作用，可用于非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的临床治疗，但其物质基础和作用机制有待进一步阐明。本研究旨在揭示YZHG治疗NAFLD的物质基础和机制。我们采用血清药物化学方法对YZHG中的成分进行鉴定；通过系统生物学预测YZHG治疗NAFLD的潜在靶标，然后通过分子对接进行初步验证；此外，通过16S rRNA测序和非靶向代谢组学阐明了YZHG在NAFLD小鼠中的功能机制。结果从YZHG中鉴定出52种化合物，其中42种被吸收入血。网络药理学和分子对接表明，YZHG治疗NAFLD具有多组分和多靶点的特点。YZHG可改善NAFLD小鼠的血脂、肝酶、脂多糖（LPS）和炎症因子水平。YZHG还可以显著改善肠道菌群的多样性和丰富度，调节甘油磷脂和鞘脂代谢。此外，免疫印迹实验表明，YZHG可以调节肝脏脂质代谢，增强肠道屏障功能。YZHG可以通过改善肠道菌群的破坏和增强肠道屏障来治疗NAFLD。这将减少LPS对肝脏的入侵，从而调节肝脏脂质代谢并减少肝脏炎症。

　　研究亮点：1. YZHG潜在活性成分的鉴定；2. 揭示YZHG对NAFLD小鼠肠道菌群的影响；3. 揭示YZHG对NAFLD小鼠肝脏代谢的影响。

　　

　　论文ID

　　原名：Integrated serumpharmacochemistry, 16S rRNA sequencing and metabolomics to reveal the materialbasis and mechanism of Yinzhihuang granule against non-alcoholic fatty liverdisease译名：结合血清药物化学、16SrRNA测序和代谢组学，揭示茵栀黄颗粒抗非酒精性脂肪肝的物质基础和作用机制期刊：Journal ofEthnopharmacologyIF：发表时间：通讯作者：吴嘉瑞，张硕峰通讯作者单位：北京中医药大学中药学院

　　实验结果

　　1. 血液吸收YZHG成分的鉴定

　　如图1所示，YZHG溶液和血清样品以负离子模式进行分析。我们在YZHG溶液中鉴定出52种化合物，其中42种被吸收到血液中，主要是黄酮类化合物、酚酸和环烯醚萜类化合物。其中，YZHG溶液中共鉴定出21种黄酮类化合物，其中19种被吸收到血液中。YZHG溶液中鉴定出19种酚酸，其中14种被吸收到血液中。YZHG溶液中鉴定出10种环烯醚萜类化合物，其中8种被吸收到血液中。表1列出了相关的保留时间和质谱数据，化学结构式如图2所示。

　　1采用UPLC/Q-TOF-MS/MS技术对大鼠血清样品和YZHG溶液进行化学成分鉴别

　　

　　注：N表示在YZHG溶液中检出，而在大鼠血清样品中未检出；Y表示在YZHG溶液和大鼠血清中均能检出。

　　

　　1基于负离子模式下UPLC/Q-TOF-MS/MS色谱图的总离子流A）空白血清样品。（BYZHG溶液。（C）从口服YZHG的大鼠采集的血清样品。（D14种混合标准品，包括新绿原酸、绿原酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、京尼平苷、阿魏酸、木犀草苷、咖啡酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、千层纸素A，汉黄芩苷，黄芩素，3,4-二咖啡基奎宁酸、汉黄芩素和黄芩苷。

　　2. 网络药理学与分子对接分析

　　根据表1，共有42种化合物被吸收到大鼠的血液中，被认为是YZHG的潜在生物活性成分。我们通过网络药理学方法预测了这些成分的潜在靶点，对YZHG的346个潜在靶点进行了预测。随后，我们构建了YZHG的化合物-靶点网络（图3A）。白杨素、黄芩苷、汉黄芩素、5，7，4′-三羟基-8-甲氧基黄酮、高车前素和千层纸素A是关键化合物。NAFLD和YZHG共有103个共同靶点。YZHG-NAFLD靶标的PPI网络如图3B所示。Cytoscape 3.7.2软件中的Cytohubba用于筛选关键靶点，即TNF、PTGS2、MMP9、AKT1、EGFR和STAT3（图3C）。如表2所示，化合物与靶标之间的亲和力小于?5.0 kcal/mol，表明关键化合物和关键靶标可以紧密结合，提示YZHG可以通过这些化合物在NAFLD中发挥治疗作用，分子对接的部分结果如图4所示。

　　

　　2 UPLC/Q-TOF-MS/MSYZHG成分的化学结构进行了鉴定）环烯醚萜。（II）酚酸。（III）黄酮类化合物。（IV）其他类别的成分。成分编号与表1中的编号相同。

　　3. YZHG可减少脂质堆积

　　根据HE染色（图5A），与正常对照（C）组相比，我们在模型（M）组小鼠的肝组织中观察到更严重的肝细胞脂肪变性和炎症细胞浸润。处理后，四个给药组的肝细胞脂肪变性有所改善。图5B显示了油红O染色的结果。可以看出，C组的红色染色面积较小，M组的红色着色面积较大，表明肝脏中有大量的脂肪堆积。口服给药后，四个给药组的红色染色面积较小。此外，YZHG还影响NAFLD小鼠的肝脏重量，低剂量YZHG（YL）和高剂量（YH）组的肝脏重量显著降低（图5C）。因此，YZHG可以显著减少肝脏中的脂质沉积。

　　2关键靶点和关键化合物的分子对接结果

　　

　　

　　3网络药理学分析AYZHG的化合物靶点网络。蓝色正方形表示化合物，红色圆圈表示化合物的靶点。（BYZHG-NAFLD靶标的PPI网络。靶点的degree值越高，节点越大，颜色越深。（CYZHG治疗NAFLD的关键靶点。

　　4. YZHG可改善血脂水平和肝功能

　　如图5D-J所示，总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）、天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）和碱性磷酸酶（AKP）在M组中显著升高（P<0.05）。给药后，四个给药组的TC、TG、LDL-C、HDL-C、AST、ALT和AKP均显著降低。YH组降低AST的效果优于阳性药物（P）组。这些结果表明，YZHG可以显著改善HFD引起的小鼠血脂水平和肝酶指数的异常升高。

　　

　　4分子对接部分结果可视化

　　5. YZHG降低脂多糖和肝脏炎症

　　当肠道屏障受损时，LPS可以通过门静脉从肠道进入肝脏，并导致或加重肝脏的炎症反应。M组肝组织中LPS、TNF-α、IL-1β和IL-6显著升高，表明肝脏中的炎症反应增强（图5K-N）。YZHG处理后LPS、TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著下降，这些指标的改善程度与YZHG剂量有关。这表明YZHG可以通过减少LPS进入肝脏来改善肝脏炎症损伤。

　　

　　5 YZHGNAFLD小鼠的影响AHE染色，bar=50μm。（B）油红色O染色，bar=50μmC）肝脏重量。（DTC。（ETG。（F）低密度脂蛋白（LDL-C）。G）高密度脂蛋白（HDL-C）。（HAST。（ALT。（JAKP。（KLPS。（LTNF-α。（MIL-1β。（NIL-6。数据为X±SEM。与模型组相比，*P0.05**P0.01

　　6. YZHG改变肠道菌群组成

　　我们基于T检验进行alpha多样性分析，以评估各组之间微生物群落的差异（图6A–C）。M组的Chao1指数、ACE指数和PD_whole_tree指数均显著下降。与M组相比，YH组的Chao1指数、ACE指数和PD_whole_tree指数均显著升高。这表明HFD降低了肠道菌群的丰富度和多样性，YZHG可以显著改善NAFLD小鼠的这种情况。

　　我们基于主坐标分析（PCoA）的β多样性分析了不同处理下肠道菌群结构的变化。如图6D所示，基于binaryjaccard算法的PCoA分析显示，C组和M组的肠道微生物群特征彼此显著不同。在用YZHG处理后，NAFLD小鼠的微生物群组成被重塑为C组。此外，基于bray-curtis算法的PCoA分析也证实了这些结果（图6E）。非加权组平均法（UPGMA）是一种常用的聚类分析方法，用于评估样本之间物种组成的相似性，可用于表示β多样性。基于binaryjaccard和bray-curtis算法的样本UPGMA聚类树如图6F–G所示。这些数据进一步表明，NAFLD小鼠和其他小鼠的微生物群落结构和分布存在显著差异。

　　此外，我们比较了NAFLD小鼠在不同水平下肠道菌群相对丰度的变化。与C组相比，厚壁菌门、放线菌门、变形菌门和厚壁菌/拟杆菌门的比例的相对丰度显著增加，而在M组的门水平上，拟杆菌门、软壁菌门、Patscibacteria和酸杆菌的相对丰度显著降低（图6H–I）。与M组相比，YL组软壁菌门的相对丰度显著增加，而厚壁菌门和变形菌门的相对丰度在YH组中显著降低，Patescibacteria和软壁菌门的相对丰度显著增加。YH组可以降低厚壁菌门/拟杆菌门的比例，但没有显著差异。在属水平上（图6J–K），乳酸杆菌、双歧杆菌和脱硫弧菌的相对丰度显著增加，而Ruminococcace AE_UCG-014在M组中比在C组中显著降低。处理后，RuminococcaceAE_UCG-014在三种剂量的YZHG中显著恢复。乳酸杆菌和脱硫弧菌在YH组中显著恢复。这些数据表明，YZHG可以重塑NAFLD诱导的肠道菌群相对丰度的变化。

　　LefSe分析用于搜索各组之间的统计生物标志物。我们筛选LDA评分>4的生物标志物，并显示为LDA直方图（图6L）和LefSe进化分支图（图6M）。LefSe分析表明，Patescibacteria和拟杆菌门是门水平的生物标志物。Candidatus_Saccharmonas、双歧杆菌、Blautia、Ruminococcacee_UCG_014和拟杆菌属是属水平生物标志物。

　　YZHG不仅能改变NAFLD小鼠的肠道菌群组成，还能改善其血清生化指标。因此，Spearman相关性分析揭示了肠道菌群与血清生化指标之间的相关性（图6N）。在门水平上，Patescibacteria与TC、LDL-C、HDL-C、AST、ALT和AKP呈负相关，而疣微菌门与TG、ALT和LDL-C呈负相关。酸杆菌与TC、TG和HDL-C呈正相关；拟杆菌门与TG呈正相关，厚壁菌门和变形菌门与ALT呈正相关。如图6O所示，在属水平上Ruminococcacee_UCG?014与AST、ALT和AKP呈负相关。阿克曼氏菌与LDL-C、TG和ALT呈负相关，Faecalibaculum与LDL-C、TG、ALT和AKP呈负相关。乳杆菌与TC、LDL-C、HDL-C、AST和ALT呈正相关。脱硫弧菌与AST和ALT呈正相关。这些结果表明，NAFLD小鼠给药前后生化参数的改善与肠道菌群有关。

　　

　　6微生物多样性分析结果alpha多样性分析。（AChao1指数。（BACE指数。（CPD_whole_tree指数。数据为X±SEM。与模型组相比，*P0.05**P0.01IIbeta多样性分析。（D）基于binary jaccard算法的PCoA分析。（E）基于bray-curtis算法的PCoA分析。（F）基于binary jaccardUPGMA分析。（G）基于bray-curtis算法的UPGMA分析。III：物种分布直方图。（H）以及（）在门水平上肠道微生物群落的相对丰度。（J）和（K）属水平上肠道微生物群落的相对丰度。IVLefSe分析。（LLDA直方图。（M）进化分支图。VSpearman相关性分析。（N）门水平上肠道菌群与血清生化指标的相关性。（O）属水平上肠道菌群与血清生化指标的相关性。*P<0.05**P<0.01***P<0.001

　　7. YZHG调节肝脏代谢

　　我们使用非靶向肝脏代谢组学分析来进一步评估YZHG对NAFLD的改善作用，通过监督正交偏最小二乘分析（OPLS-DA）评估各组之间代谢谱的总体差异。R2X、R2Y和Q2是OPLS-DA模型的重要预测参数。R2Y和Q2越接近1，模型就越可靠和稳定。通常，当Q2>0.5时是有效的模型，当Q2>0.9时是优秀的模型。如图7A–E和K–O所示，M组和其他组可以划分为不同的区域（Q2>0.7），表明M组的肝脏代谢与其他组的肝脏代谢显著不同。根据倍数变化（FC）>1，t检验的P值<0.05，OPLS-DA模型的VIP值>1，我们获得差异代谢产物。各组差异代谢物的筛选结果如火山图所示（图7F–J和P-T）。在正离子和负离子ESI模式中，C组和M组之间有1018种不同的代谢物。这些代谢产物中的大多数在YL、YM和YH组之间共享。与M组相比，P、YL、YM和YH组分别有1360、999、1206和1437种不同的肝脏代谢产物。YZHG可以逆转HFD引起的肝脏代谢产物的变化，YL组有65种代谢产物逆转，YM组有145种代谢产物反转，YH组有153种代谢产物倒转。这表明YZHG可以逆转HFD引起的代谢变化。

　　MetaboAnalyst 5.0数据库(https://www.metaboanalyst.ca/)用于分析关键逆转代谢产物的代谢途径，以阐明YZHG对NAFLD小鼠肝脏代谢途径的影响。我们发现涉及18种相关代谢途径，如图8A所示，其中对甘油磷脂代谢的影响最为显著，其次是鞘脂代谢，咖啡因代谢是影响最大的因素。YZHG可以通过改变代谢产物来调节这些重要的代谢途径，以治疗NAFLD。

　　以上结果表明，YH组具有良好的治疗效果。因此，我们对在门水平的不同肠道菌群和YH组逆转的前50种关键肝脏代谢产物之间进行了Spearman相关性分析（图8B）。厚壁菌门相对丰度的变化与肝脏代谢产物如4-乙基-2,5-二甲基噻唑、CE（12:0）和formaldehyde-glycine有关。变形杆菌相对丰度的变化与葡糖神经酰胺、2-氨基马来酸、pantoyllactone glucoside和其他肝脏代谢产物密切相关。

　　

　　7肝脏的非靶向代谢组学分析ESI+中的OPLS-DA得分图。IIESI+中差异代谢物的火山图。IIIESI-中的OPLS-DA得分图。IVESI-中各组之间差异代谢物的火山图。

　　

　　8通路分析和Spearman分析A）关键逆转代谢产物的代谢途径分析。（BYH组不同门水平肠道菌群与前50种关键逆转代谢产物之间的Spearman相关性分析。

　　8. YZHG调节脂质代谢和肠屏障功能

　　与C组相比，M组ACC1、FASN和CD36的蛋白表达相对增加，但差异无统计学意义（图9A-C）。处理后，四个给药组ACC1、FASN和CD36的表达均显著降低（P<0.05）。这些结果表明，YZHG可以通过调节脂质蛋白的表达来治疗NAFLD。

　　

　　9 YZHGNAFLD小鼠肝组织和结肠中蛋白质表达的影响(A) ACC1(B) FASN(C) CD36(D) ZO1(E) Occludin(F) Claudin 1。数据为X±SEM。与模型组相比，*P0.05**P0.01

　　与C组相比，M组ZO1、Occludin和Claudin 1的表达显著降低（P<0.05）（图9D–F）。YL组、YM组、YH组和P组ZO1、Occludin和Claudin 1的表达均显著增加（P<0.05）。因此，YZHG可以通过调节肠道紧密连接蛋白的表达来改善NAFLD小鼠肠道屏障功能的损伤。

　　在本研究中，我们通过UPLC/Q-TOF-MS/MS共检测到YZHG的42种血液衍生成分。然而，本研究中鉴定的YZHG的血液衍生成分仅为原型化合物，未考虑这些化合物在体内的代谢。我们应进一步研究YZHG的代谢产物，为阐明YZHG作用机制提供依据。本研究采用血清药物化学方法对YZHG的药效物质进行了研究，以正常大鼠血清为有效成分载体。然而，在动物的正常和病理状态下，药物的吸收和分布存在差异，药物的代谢和排泄也有所不同。因此，我们应进一步研究YZHG的体内外药代动力学，并比较YZHG在正常动物和NAFLD动物中的吸收、分布、代谢和排泄情况，以进一步揭示YZHG药效学物质基础。本研究的血清药物化学结果为今后研究YZHG的体内外药代动力学提供了初步依据。

　　血清药物化学结果初步揭示了YZHG潜在的活性成分，并通过网络药理学进一步探讨了YZHGs治疗NAFLD的潜在机制。网络药理学和分子对接分析表明，白杨素、黄芩素、汉黄芩素、5，7，4′-三羟基-8-甲氧基黄酮、高车前素和千纸层素A是关键的活性成分。白杨素可以通过激活血管紧张素转化酶2/血管紧张素（1-7）/Mas受体轴和调节肝脏肾素-血管紧张素系统来改善NAFLD的进展。黄芩素可以通过调节棕色脂肪细胞中线粒体解偶联蛋白-1的表达来治疗代谢和肥胖相关疾病。此外，黄芩素可以调节肠道菌群的生态结构和肝脏脂质代谢，从而治疗NAFLD。汉黄芩素可能通过上调肝脏PPARα/AdipoR2来治疗NAFLD。中医药治疗疾病是一个复杂的过程，涉及各种成分的相互作用。在本研究中，YZHG活性成分在体内的转化和功能有待进一步研究。

　　

　　10 YZHGNAFLD的保护作用机理示意图增加。减少。Figdraw绘制。

　　肠道菌群可以通过调节肠道微环境来协调免疫系统反应并维持身体稳态。IFD可导致或促进NAFLD。因此，靶向肠道菌群治疗NAFLD是有希望的。本研究发现，京尼平苷和绿原酸这两种YZHG的重要成分联合使用，可以通过调节肠道菌群组成和增强肠道屏障功能来治疗NAFLD。本研究16S rRNA测序显示NAFLD小鼠肠道菌群的多样性和丰富度显著降低，YZHG有显著改善。此外，先前的研究发现，NAFLD小鼠的厚壁菌门、放线菌门、变形菌门、乳杆菌、双歧杆菌显著增加，拟杆菌门显著减少，这与本研究一致。此外，在NAFLD患者或动物模型中，厚壁菌门/拟杆菌门的比例增加，这也与本研究一致。YH组能够降低厚壁菌门/拟杆菌门的比例，但没有显著降低。总之，YZHG对HFD引起的IFD具有调节作用。

　　HFD引起的IFD通常与肠道屏障功能障碍有关。肠道屏障的损伤会增加肠上皮的通透性，使各种有毒物质进出肠道，导致全身炎症，进而通过“肠肝轴”促进肝脏系统的疾病。肠上皮粘膜的紧密连接蛋白可以通过维持肠道的屏障功能来防止过量的有毒物质进出肠壁和血液，可用于评估肠道的通透性。ZO1、Occludin和Claudin 1是维持肠上皮屏障功能的紧密连接蛋白。在这项研究中，HFD可以降低结肠中屏障相关蛋白的表达，导致肠道屏障功能障碍。YZHG给药后ZO1、Occludin和Claudin 1的表达显著增加。这些结果表明YZHG可以通过改善肠道屏障功能来调节IFD。

　　有充分证据表明IFD会损害肝脏稳态，导致代谢功能障碍，并促进NAFLD的发生和发展。非靶向肝脏代谢组学显示，YZHG逆转了NAFLD小鼠中HFD改变的多种代谢产物。根据“肠肝轴”理论，肠道菌群影响宿主代谢，肝脏代谢产物的变化在一定程度上反映了肠道菌群的变化。代谢途径分析表明，YZHG主要影响甘油磷脂代谢、鞘脂代谢和咖啡因代谢。临床试验表明，在50名患者中，甘油磷脂代谢与NAFLD的相关性最强，药物可以通过靶向甘油磷脂代谢途径来治疗NAFLD。几项动物研究报告称，在NAFLD动物模型的肝脏中，甘油磷脂代谢产物PC和PE的转化率增加，这与本研究一致。除了甘油磷脂外，鞘脂还影响NAFLD的发展和进展。此外，甘油磷脂和鞘脂是脂质，这表明YZHG影响NAFLD小鼠的脂质代谢。

　　肝脏脂质代谢异常影响NAFLD的发生和发展。在NAFLD患者中，肝脏新生脂肪生成可以驱动脂肪酸合成，并促进20-25%的肝脏甘油三酯的沉积。ACC1（乙酰辅酶A羧化酶1）可以调节新生脂肪生成的通量，其在NAFLD患者的肝脏中上调。FASN（脂肪酸合成酶）具有控制肝脏新生脂肪生成的强大限速能力，在NAFLD患者中高度表达。ACC1和FASN是肝脏新生脂肪生成的最主要调节因子，也是NAFLD潜在的治疗靶点。CD36是脂肪酸进入肝细胞并直接影响脂肪酸流动的蛋白。CD36的表达在NAFLD患者的肝脏和动物模型中显著升高。在本研究中，YZHG可以通过下调ACC1和FASN的蛋白表达来减少脂肪酸合成，并通过下调CD36的蛋白表达减少脂肪酸吸收，从而影响脂肪肝代谢。

　　结论

　　总之，本研究表明YZHG可用于治疗HFD引起的NAFLD（图10）。YZHG可显著改善HFD引起的肝脏酶和血脂水平异常，改善肝脏脂质代谢和肠道屏障功能，减少肝脏中的脂肪堆积。此外，YZHG可以通过增加物种丰富度和多样性以及调节微生物组的相对丰度来调节IFD。非靶向肝脏代谢组学研究表明，YZHG可以调节HFD诱导的甘油磷脂和鞘脂的代谢异常。然而，非靶向代谢组学分析虽然涵盖了广泛的内源性物质，但仍然存在敏感性和特异性差的问题。16S rRNA测序缺乏预测肠道菌群功能的能力。因此，我们有必要通过宏基因组测序和靶向代谢组学进一步研究YZHG对肠道菌群和肝脏代谢的详细调控。

　　https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36990301/

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