西北大学李延&周亚倩Anal. Chem.：均相电化学发光高灵敏测定脱甲基酶FT

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　　研究内容

　　脂肪量和肥胖相关蛋白(FTO)是第一个报道的N6-甲基腺苷(m6A)RNA去甲基化酶。FTO去甲基化的失调以m6A依赖的方式与各种人类癌症密切相关。

　　西北大学李延和周亚倩提出了一种基于靶调控DNA酶切割的均相电化学发光(ECL)测定FTO的方法。此外，β-环糊精(β-CD)和三正丙胺(TPrA)之间的主客体相互作用高度增强了ECL信号。m6A笼状脱氧核酶17E-Me充当挂锁，FTO充当相应的钥匙。FTO可以特异性地去除m6A修饰，恢复DNAzyme 17E的切割活性。在Zn2+辅因子的帮助下，底物链在特定位点被裂解，Ru(phen)32+的ECL指示剂被放电以产生ECL信号。结果表明，ECL强度与FTO浓度的对数线性相关(0.0001到100 nM)，检测限较低(30fM)。FTO抑制剂大黄酸和甲氯芬酸的IC50值分别为35.6 μM和20.3 μM。相关工作以“Homogeneous Electrochemiluminescence for Highly Sensitive Determination of Demethylase FTO Based on Target-Regulated DNAzyme Cleavage and Host-Guest Interaction”为题发表在国际著名期刊Analytical Chemistry上。

　　

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　　研究要点

　　要点1.作者提出德基于靶调控DNA酶切割的去甲基酶FTO测定的同质ECL检测平台。在不存在FTO的情况下，m6A笼状的17E-Me与S杂交，并且Ru(phen)32+插入到S:17E-Me双链体中。在用Zn2+处理之后，17E-Me保持在OFF状态。在这种情况下，Ru(phen)32+仍然包埋在双链中，并且可以随着磁分离而被去除，留下具有可忽略不计的Ru(phen)32+的上清液。

　　要点2.在FTO存在下，m6A修饰的去除特异性地诱导活性DNAzyme的有效回收。17E处于ON状态，其中底物链被分裂成两个片段并与DNAzyme解离。大量Ru(phen)32+被释放到上清液中，可用于ECL法定量测定FTO。

　　要点3.对于ECL检测，β-CD@AuNPs修饰德电极通过静电吸附浓缩Ru(phen)32+，通过与β-CD的主客体相互作用聚集TPrA分子，从而产生强烈的ECL响应。结果表明，ECL强度与FTO浓度的对数线性相关(0.0001到100 nM)，检测限较低(30fM)。FTO抑制剂大黄酸和甲氯芬酸的IC50值分别为35.6 μM和20.3 μM。该策略被进一步验证用于MCF-7细胞裂解物和Hela细胞裂解物中的FTO检测。

　　这项工作表明，该策略有望开发用于检测FTO和筛选去甲基酶抑制剂的同质ECL方法。

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　　研究图文

　　

　　图1.（A）β-CD@AuNPs的紫外-可见吸收光谱。插图：金胶体溶液的照片。（B）β-CD@AuNPs的TEM。（C）β-CD@AuNPs尺寸分布的直方图。（D）β-CD@AuNPs的高分辨率TEM。（E）β-CD@AuNPs的1H NMR光谱(400MHz，D2O)。（F）原始β-CD和β-CD@AuNPs的FT-IR。

　　

　　图2.（A）β-CD、TPrA和包合物的IGM等表面分析的优化分子构型。（B）具有不同比例的TPrA/β-CD（1:1-1:5）的TPrA(2 mM)的1H NMR光谱(400 MHz，D2O)。右边的比率代表TPrA/β-CD的摩尔比。字符1-3表示TPrA分子上的质子。

　　

　　图3.（A）不同情况下的ECL响应。条件：0.1 M PBS（pH 7.4），含有2 mM TPrA，扫描速率为100 mV·s-1。（B）FTO调控DNA酶切割反应的PAGE表征。泳道1:S(1 μM)；泳道2:17E(1 μM)；泳道3:S(5 μM)+17E(1 μM)(不含Zn2+)；泳道4:S(5 μM)+17E(1 μM)(含50 μM Zn2+)；泳道5:S(5 μM)+17E Me(1 μM)(含50 μM Zn2+)；泳道6：S(5 μM)+17E Me(1 μM)+FTO(100 nM)(含50 μM Zn2+)。

　　

　　图4.（A）靶调控DNAzyme切割平台的ECL反应与不同浓度的FTO: 0.0001，0.001，0.01，0.1，1，10，100 nM有关。（B）通过绘制ECL强度与FTO浓度对数的关系绘制靶调控DNAzyme切割平台的校准曲线。（C）用FTO(1 nM)、BSA(50 μg/mL)、凝血酶(100 nM)，IgG(100 nM)、ATP(5 mM)、GSH(5 mM)和葡萄糖(5 mM)处理的17E-Me的ECL反应。****P值<0.0001，基于Student t检验。（D）FTO抑制剂rhein、MA和阴性对照IA的剂量依赖性抑制谱，如通过靶调控的DNAzyme切割平台评估的。

　　

　　图5. 实际样品分析：细胞数量从1个增加到10000个的MCF-7细胞（A）和Hela细胞（B）的ECL强度与对数的校准图。

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　　文献详情

　　Homogeneous Electrochemiluminescence for Highly Sensitive Determination of Demethylase FTO Based on Target-Regulated DNAzyme Cleavage and Host-Guest Interaction

　　Xia Yang, Shuai Qiao, Wei Zhao, Sijia Li, Yanxia Qiao, Yang Jiang, Yaqian Zhou,* Yan Li*

　　Anal. Chem.

　　DOI: https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c01661

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