“药物+铁死亡+疾病+通路”四步教会你设计实验!
欢迎来小薇的日更公号科研显微镜,如果亲比较缺乏SCI写作经验,自己修改起来费时费力,效果还不一定好,时间久了创新性下降,可以请小薇进行评估,或修改润色哦。
铁死亡是近年来研究的热点,小薇之前给大家介绍了几个“单基因+通路+热点细胞死亡”实验设计套路,那有小伙伴想研究药物,不知道怎么着手,别着急,小薇今天以下面这篇文献为例,四步教会大家设计“药物+铁死亡+疾病+通路”实验,一起往下来看吧~
首先作者展示了圣草酚的二维和三维结构图(图1A和B)。接着用圣草酚处理卵巢癌细胞(CaoV3和A2780细胞),发现CaoV3和A2780的细胞活力以圣草酚剂量依赖的方式降低(图1C),此外,CaoV3的细胞凋亡以圣草酚剂量依赖性的方式显著升高(图1D)。说明圣草酚抑制卵巢癌细胞活力,诱导细胞凋亡。
为了进一步研究圣草酚对卵巢癌细胞铁死亡的影响,本研究检测了CaoV3和A2780细胞中的Fe2+水平、ROS积累以及SLC7A11和GPX4的蛋白水平(铁死亡相关指标)。首先,将细胞系用不同浓度的圣草酚处理,发现CaoV3和A2780细胞中的Fe2+水平增加(图2A)。此外,Erastin(铁死亡诱导剂)显著增强了圣草酚对Fe2+水平的影响,Ferrostatin-1(铁死亡抑制剂)挽救了其作用(图2B)。并且圣草酚处理显著增加了ROS的产生(图2C)。为了进一步证实圣草酚对铁死亡的作用,检测了SLC7A11和GPX4的表达,发现浓度为50和100 μM的圣草酚显著降低了CaoV3和A2780细胞中SLC7A11和GPX4的蛋白表达水平(图2D)。这些结果表明,在CaoV3和A2780细胞中,圣草酚引发了铁死亡。
接着作者进一步研究圣草酚是否会影响卵巢癌细胞线粒体功能,利用流式细胞仪使用JC-1检测试剂盒对MMP进行测量 [红色表示线粒体具有高(活性)值,绿色区域表示低(非活性)ΔΨm值]。结果发现圣草酚降低了CaoV3和A2780细胞中JC-1荧光比(红/绿)的比率(图3A和B)。还检测了GSH和MDA的水平以评估MMP,结果发现圣草酚显著降低了GSH水平,但增加了MDA水平(图3C和D)。并且,圣草酚提高了细胞色素C蛋白的表达(图3E)。这些发现表明,在CaoV3和A2780细胞中,圣草酚加重了线粒体功能障碍。
此外,作者进一步研究了圣草酚对Nrf2信号通路的调节作用。基于上述结果,这部分选择CaoV3细胞进行实验。HO-1和NQO1是Nrf2下游基因,因此进一步研究了圣草酚是否在CaoV3细胞的Nrf2信号通路中介导HO-1或NQO1。结果发现HO-1和NQO1的蛋白质水平以及Nrf2磷酸化明显被圣草酚下调,这被BM(甲基巴多索隆,Nrf2激活剂)处理部分挽救(图4A和B)。此外,与对照组相比,BM处理增强了细胞活力(图4C),但下调了Fe2+水平(图4D)。还观察到BM处理提高了GSH水平(图4E),但降低了MDA含量(图4F)。这些结果表明,圣草酚可能通过Nrf2/HO-1/NQO1信号通路调节卵巢癌细胞的细胞活力、铁死亡和线粒体功能。
最后,作者进一步在小鼠体内探讨了圣草酚对卵巢癌的抑制作用。结果发现与对照组相比,圣草酚时间减少了肿瘤体积和体重(图5A-C)。并且与对照组相比,圣草酚处理显著降低了肿瘤重量的平均值(图5D)。H&E染色结果表明,与对照组相比,圣草酚明显降低了肿瘤切片的染色强度(图5E)。IHC分析显示,圣草酚显著降低了Nrf2的表达(图5F)。此外,还发现与对照组相比,圣草酚显著下调GSH水平,上调MDA水平(图5G和H)。研究结果表明,圣草酚抑制肿瘤生长,加重线粒体功能障碍,降低卵巢癌肿瘤组织中的Nrf2水平。
好啦,以上四个步骤简单吧,以文献为例就比较好理解啦,都学会啦吧,有问题的可以留言哈,快收藏起来吧~
没有研究方向的小伙伴也不要着急,小薇这里还提供实验设计服务,有需要的小伙伴随时联系小薇,小薇一直都在~
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