单域抗体(“纳米抗体”)在实验室诊断中的应用

　　几十年来，抗体已被证明是诊断方法发展的核心，从多克隆抗体到单克隆抗体的里程碑式发展。尽管单克隆抗体在诊断中起着重要的作用，但是它们的生产在技术上要求很高，而且价格昂贵。单克隆抗体的大尺寸(150 kDa)使得使用重组方法对其进行改造成为一项挑战。单结构域抗体，如“纳米抗体”，是一种相对较新的诊断探针，它是在骆驼血清分析过程中偶然发现的。

　　骆驼科(骆驼、美洲驼和羊驼)的免疫系统已经独特地进化产生重链抗体，该抗体在12-15 kDa的较小功能单位中包含单个单体可变抗体结构域。有趣的是，在鲨鱼身上也观察到了同样的生物现象。由于单结构域抗体分子比传统的哺乳动物抗体小，所以使用细菌生产系统的体外重组工程和蛋白质表达要简单得多。编码这种抗体的完整基因可以在体外克隆和表达。单结构域抗体非常稳定且耐热，因此不需要冷藏，尤其是当结合到诊断试剂盒中时。它们简单的遗传结构使蛋白质易于改造，以引入新的抗原结合特性或贴上标签。在这里，我们回顾了单结构域抗体在实验室诊断中的应用，并讨论了这一领域的未来潜力。

　　图1.标准Ig结构与纯重链抗体的结构比较

　　配体结合分析是实验室医学中测量分析物和生物标志物的基础。这类分析利用了分析物或生物标记和特定亲和试剂之间的结合反应。在免疫测定中，亲和试剂是抗体。免疫测定是蛋白质生物标记测量的主要方法，可以测量健康和患病状态下的许多蛋白质。一些靶蛋白大量存在(> 10 mg/mL)，而其他的在临床样品中发现浓度非常低(< 1 pg/mL)。合适的免疫测定法的发展取决于蛋白质抗原的可用性和宿主动物中免疫反应的产生以及随后抗体的产生。由于免疫反应的固有多样性以及不同抗体对相同抗原的结构和结合亲和力，在一种检测或平台中使用的抗体表现不同除非它们是单克隆抗体的同一个克隆。对于相同的分析物，例如促甲状腺激素和癌抗原19-9，不同平台之间的不同结果有许多例子。蛋白质分析物的翻译后修饰可能是影响与抗体反应性并导致不同结果的另一个因素。Goodman概述了在实验室使用常规抗体的挑战。然而，免疫测定存在许多问题。一般来说，抗体可以来自多克隆或单克隆来源。尽管多克隆抗体易于生产，但其本质上是可变的，血清中可能存在批次间的差异。多克隆抗体具有能够识别复杂抗原的多个表位的优点，但是生产中的不一致性阻碍了它们的应用。单克隆抗体的发展是基于配体的分析发展的一个里程碑。单克隆抗体识别单个表位，并且可以从杂交瘤中无限期地产生纯的和均一的形式。虽然单克隆抗体在诊断中有重要作用，但其生产技术要求高，而且价格昂贵。此外，单克隆抗体的大小(150 kDa)使得使用重组方法对其进行改造成为一项挑战。因此有需要开发用于实验室诊断的新的稳定可靠的抗体探针。常规抗体或互补核酸序列代表了用于检测各种靶分子的最常见形式的探针。多年来，已经尝试通过酶消化方法(例如，使用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)或通过重组工程方法(例如，使用片段抗原结合(Fab)、单链可变片段(ScFv)和可变片段(Fv)的方法)将抗体还原成片段。骆驼科动物中天然存在的纯重链抗体(HCAbs)的发现预示着抗体工程的新时代。

　　与抗原复合的纳米抗体的三维结构

　　纳米抗体对其抗原的平均亲和力约为6 nM，这与常规抗体的单体抗原结合位点(Fab或ScFv)对其抗原的亲和力相当。X射线晶体学揭示了许多纳米体的结构。VHH包含具有九条β链的IgV折叠和Cys23和Cys104之间的保守二硫键(国际免疫遗传学[IMGT]信息系统编号；图2)。V结构域包含由四个保守框架区连接的三个高变环。纳米抗体上的抗原决定簇富含类似于传统抗体的芳香残基。纳米抗体和抗原之间的相互作用由三个互补决定区(CDR)环介导，并由CDR3环控制。抗原表位趋向于更加刚性和凹陷，并且也富含芳香残基。相比之下，常规抗体使用六个CDR环(三个在重链可变区，三个在轻链可变区)进行抗原结合。这些结构见解有助于将纳米抗体合理设计成更有效的亲和试剂

　　图2.同二聚体重链抗体（左下）的结构，

　　如本综述所示，纳米体在临床实验室，特别是在感染性疾病以及成像方面，用于诊断目的的未来应用能会越来越多。

　　原文链接：https://doi.org/10.3343/alm.2021.41.6.549

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