艾美捷SAM甲基转移酶活性分析试剂盒使用前准备方案

　　关键生物分子和蛋白质的甲基化在许多生物系统，包括信号转导、生物合成、蛋白质修复、基因沉默和染色质调节。S-腺苷甲硫氨酸（SAM）依赖性甲基转移酶使用SAM ATP后最常用的酶辅因子。SAM，也称为AdoMet作为修饰蛋白质和DNA所需的甲基的供体。SAM的异常水平与许多异常有关，抑郁症、帕金森氏症、多发性硬化症、肝衰竭和癌症。SAM510:SAM甲基转移酶测定是一种连续的酶偶联测定可以连续监测SAM依赖性甲基转移酶（3），无需使用放射性标签或终点测量。

　　艾美捷G-Biosciences SAM510系列——SAM甲基转移酶活性分析试剂盒，提供一种连续动力学酶偶联测定方法，可连续监测纯化的SAM依赖性甲基转移酶，而无需使用放射性标记或终点测量。 这是用于蛋白SAM甲基转移酶的灵敏的酶偶联试验。

　　艾美捷SAM甲基转移酶活性分析试剂盒使用前准备：

　　1.解冻SAM甲基转移酶测定缓冲液和SAM甲基转移蛋白测定室温下的缓冲添加剂溶液。添加SAM的整个卷SAM甲基转移酶测定缓冲液添加剂缓冲并充分混合。将SAM甲基转移酶测定缓冲液储存在室内添加添加剂后，不要冻结。

　　2.阳性对照：腺苷同型半胱氨酸：小瓶中含有200μl的1mM腺苷同型半胱氨酸（AdoHcy）溶液。在冰上解冻小瓶。

　　3.SAM酶混合物，以300μl小瓶提供。每个小瓶适用于36次分析。解冻在冰上只需要您进行化验所需的小瓶数量。不建议SAM酶混合物的重复冷冻/解冻。

　　4.S‐腺苷蛋氨酸（SAM），冻干供应。重新构成用100μl HCl测定试剂[20mM]的小瓶，产生6.9mM SAM。每个小瓶适用于36次测定。不建议重复冷冻/解冻腺苷蛋氨酸溶液。

　　5.冻干的SAM比色混合物。添加1ml SAM甲基转移酶测定向SAM比色混合物小瓶中加入添加剂的缓冲液。等待5分钟，然后直到溶解。如果没有使用所有SAM色度混合，建议等分成更小的小瓶，并在-70°C下储存。

　　6.样品制备：准备含有纯化SAM的测试样品根据您自己的标准，检测依赖性甲基转移酶协议避免使用还原剂和金属螯合剂，因为它们具有对反应的抑制作用。如果存在这些试剂，建议使用O型管分析仪? 针对0.1M Tris透析样品的微型装置盐酸，pH8.0。

　　7.使用SAM甲基转移酶测定缓冲液或您自己选择的缓冲液。避免使用还原剂和金属螯合剂，因为它们对反应。

　　艾美捷SAM甲基转移酶活性分析试剂盒协议：

　　注：提供的阳性对照是SAM甲基转移酶对照化验一些受体底物、抑制剂、活化剂或缓冲组分可能干扰测定。强烈建议测试以下各项的兼容性使用阳性对照进行SAM甲基转移酶测定的试剂将可疑的不相容试剂替换到阳性对照反应中。有必要滴定测定中的每个酶/底物系统，以确定最佳条件。

　　注意：SAM甲基转移酶测定中的脱氨酶需要存在于SAM甲基转移酶测定缓冲液中的二价金属离子。这个螯合剂（如EDTA）的存在会耗尽二价金属离子并抑制脱氨酶。如果需要EDTA，则补充额外的锰离子进入反应。

　　注：还原剂，包括DTT、β-巯基乙醇和TCEP，具有对测定的抑制作用。如果存在，建议对0.1M Tris进行透析盐酸，pH8.0。

　　SAM甲基转移酶活性分析试剂盒测定范围：

　　测定的检测范围为0.013‐0.133μmol/min/ml甲基转移酶其相当于每分钟0.01至0.1的吸光度。

　　

　　图1：SAM510测定定量测定阳性对照：50μM腺苷同型半胱氨酸（AdoHcy）。

　　图2： 人赖氨酸特异性组蛋白甲基转移酶SET7/9 20μM TAF‐10作为受体底物。

　　参考文献：

　　1. Cheng, X. and Blumenthal, R.M. (1999) S‐Adenosylmethionine Dependent

　　Methyltransferases: Structures and Functions, World Scientific, Singapore.

　　2. Schubert, H.L. et al. (2003) Trends Biochem. Sci 28: 329‐335.

　　3. Dorgan, K.M. et al. (2006) Anal. Biochem. 350:249‐255.

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