短肽在靶向药物递送系统中的研究进展

　　孙 艳，王 驰Acta Pharmaceutica Sinica 2008,43(10):992-996

　　摘要：

　　近年来研究发现许多肿瘤细胞表面高表达一些肽类受体，这些肽类受体与相应的配体亲和性高，能以配 体-受体方式特异性结合。以小片段活性肽作为导向物形成复合物而发展的靶向药物递送系统，能够将药物定向转 运到靶细胞内，显示了良好的研究价值和应用前景。如蛙皮素/胃泌素释放肽受体介导的靶向药物递送系统、生长 抑素受体介导的靶向药物递送系统、十肽SymB3受体介导的靶向药物递送系统、黄体酮释放激素受体介导的靶向药 物递送系统及其他肽类受体介导的靶向药物递送系统，其中短肽作为靶向基团与阿霉素、吡咯阿霉素、甲氮蝶呤、顺 铂和喜树碱等结合形成高效的复合物，用于表达有相应受体的肿瘤，获得靶向治疗的研究非常有意义。

　　多肽分子是机体内重要的一类生物活性物质。与蛋白质比较，具有分子质量小，制备容易，抗原性? 弱，毒副作用小等优点，在医药研究和临床应用上越? 来越受到重视。目前，临床已经使用的多肽类激素? 有谷胱甘肽(3肽)、胸腺五肽(5肽)、奥曲肽(8 ?肽),催产素(9肽)、环孢素A(11肽)、生长抑素(14 ?肽)和促黄体释放激素等。由于小片段肽的低毒? 性、靶向性、无免疫原性、良好的生物相容性以及本身的治疗作用等特点，同时肿瘤细胞表面高表达肽 类受体的发现，使得一些短肽可被作为导向物，以配 体-受体特异性结合的方式应用于靶向药物递送系 统(drug delivery system,DDS) 。目前短肽在各种肽 类受体介导的靶向药物递送系统中的作用受到越来 越广泛地研究。利用肽与其受体的特异性结合特 性，将肽与药物结合形成复合物，增加药物在体内的 选择性，减少药物的毒副作用，为提高药物的治疗指 数提供了可能性，显示了良好的研究价值和应用前 景。本文综述了肽类作为导向物在靶向药物递送系 统中的研究进展。

　　1 蛙皮素(bombesin,BN)/ 胃泌素释放肽(gastrin releasing peptide,GRP)受体介导的靶向药物递送系统

　　Keller等[应用RT-PCR技术及放射配基结合? 实验对3种肾癌细胞株(A-498,ACHN及786-0)进? 行了分析，结果证明了这些细胞株的细胞膜上都有? BN/GRP受体的表达。将一种蛙皮素Gln-Trp-Ala-? ?Val-Cly-His-Leu-(CHz-NH)-Leu-NH2(RC-3094)作? 为配体，与吡咯琳阿霉素(2-pyrrolinodoxorubicin, ? P-DOX,AN-201)制成蛙皮素的复合物(AN-215), 发现AN-215与肾癌细胞膜上的GRP受体的亲和力? 较高，与游离的AN-201 比较，抑瘤效果更显著， A-498、ACHN及786-0肿瘤体积和重量分别减少了 64.9%、74.9%,59.2%、60.7%,67.6%、65.4%;而游离的AN-201对增殖中的肾癌细胞则基本没有 抑瘤效果。通过实时PCR分析还发现，肾癌细胞株 中AN-215发挥强的抑瘤作用并不依赖耐药基因 MDR-1或MRP-1的表达，表明RC-3094有可能靶向 多种化学药物到达肾癌细胞而不会产生耐药。Engel等[2发现AN-215与含有BN受体的5种乳腺 癌细胞株(MDA-MB-231,DU-4475,MDA-MB-468, ?MDA-MB-435及MX- 1) 的亲和力很高，而AN-215对 此肿瘤细胞增长的抑制作用达40.7%～68.4%,并? 且这种抑瘤作用发挥几乎不会诱导任何耐药基因表 达。Zhou等[3'将一种单克隆抗体OKT3与BN/GRP ?对抗物Antag2结合形成复合物OKT3xAntag2,体内 外实验发现该复合物对小细胞肺癌的间接抑制作用 达(63±18)%,还可通过激活T淋巴细胞诱导程序? 性细胞死亡，并认为这种复合物对小细胞肺癌进行 靶向免疫治疗能显著抑制肿瘤细胞的生长。

　　Nagy等[4]将羧基末端BN-(6- 14)或BN-(7- 14)? ?五肽序列的蛙皮素与阿霉素( doxorubicin,DOX)或? AN-201形成蛙皮素的复合药物，其结构共同点是在? 13位和14位之间存在一个缺失的肽键(CH2-NH或? CH2-N),与五肽序列BN/GRP受体的亲和力高。体? 外实验证明，对于表达有BN/GRP受体的胰腺癌细? 胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞和胃癌细胞都具有相似? 的抑瘤效果。Moody等1?}将喜树碱(camptothecin, ? CPT)和BN- (6-14)通过L2[N- (N-甲基-氨基-乙基) 甘氨酸氨基甲酸酯共价连接形成CPT-L2-[D-Tyr?, ?β -Ala",D -Phe'3,Nle?]Bn(6 - 14)(BA3)复合物， 实验证明CPT-L2-BA3与BN的3种受体亚型? hGRPR的亲和力很高。在体外实验中CPT-L2-BA3 ?对多种细胞增殖有抑制作用，包括乳腺癌MCF-7细胞、结肠癌HT-29细胞、胃癌Hs746T细胞、恶性胶 质瘤U-87MG细胞、非白血性白血病MOLT-4细胞、 肺癌NCI-H69细胞、成神经细胞瘤IMR32细胞、胰 腺癌CFPAC- 1 细胞、前列腺癌PC-3、DU-145和? LNCaP细胞(ICso=33~2269 nmol-L- 1) 。在体内? 实验中CPT-L2-BA3显著抑制了人类非小细胞肺癌? NCI-H1299,每周两次注射对胰腺癌CFPAC-1增长? 抑制84%。

　　2 生长抑素(somatostatin,SRIF)受体(ssts)介导的靶向药物递送系统

　　结肠直肠癌的治疗通常面临抑癌基因p53的变 异，严重阻碍了治疗的发展。Szepeshazi等[6研究 发现结肠直肠癌细胞膜上有高表达ssts。将辛肽 SRIF的类似物RC-121与AN-201连接，形成靶向 的SRIF复合物(AN-238),能够将药物AN-201定 向转运到肿瘤细胞，使得肿瘤细胞内药物的浓度大 大提高，克服了抑癌基因p53的变异阻碍。免疫痕? 迹分析表明对表达有ssts的4种结肠癌细胞株 HCT- 116 、HCT- 15 、HT-29和LoVo;其中HCT- 116 ?和LoVo表达有p53,HCT-15、HT-29表达有变异型? p53,而LVo不表达功能性的ssts。体内实验结果? 表明，AN-238基本不影响p53的水平，并可增加其 活性，而同剂量DOX和AN-201显著提高p53的水 平且多数p53变异、不活泼。对于表达有p53的 HCT- 116裸鼠肿瘤细胞， AN-201、DOX、AN-238 的作 用基本相同。对于无功能性ssts表达的LoVo细胞 则均没有明显作用。对于表达有变异型p53的细胞 ICT-15和IIT-29,仅有AN-238有明显的抑制作用， 证明了此抑瘤作用并不依赖p53的表达，HCT-116、 HCT-15、HT-29和LoVo肿瘤的体积和重量分别减少：74%、74.2%,78%、72%,74%、69.6%,38%、 47.2%。

　　3 十肽SynB3受体介导的靶向药物递送系统

　　近年来，Castcx等[7 研究了许多小分子肽类载 体及其应用，比如十肽SynB3。它能靶向药物的脑 部吸收，包括抗肿瘤药物DOX。将一种十肽载体 SynB3与AN-201通过丁二酸酐共价连接形成复合 物P-DOX-SynB3,该复合物能显著增加AN-201 的脑 部吸收同时伴随减少其心脏毒副作用。共聚焦显微 镜下观察P-DOX-SynB3聚集浓度同游离的P-DOX 相似；体外毒性研究表明，其毒性明显高于DOX而 略低于P-DOX。研究发现该复合物能靶向脑部肿 瘤组织，增加DOX的脑部吸收，减少其心脏毒性却 不影响其药效发挥。针对白血病细胞株K562和卵巢癌细胞株A2780,ECs分别为(2.29±0.70)和 (1.44±0.70)nmol · L-',细胞死亡率分别达 (91.14±0.8)和(98.1±0.8)%。

　　4 黄体酮释放激素(LH-RH)受体介导的靶向药物递送系统

　　Buchholz等[8]把一种黄体化的激素释放激素? (luteinizing hormone-releasing hormone,LH-RH)作为? 靶向配体，连接上DOX或AN-201形成复合物(AN- 207)。对乳腺癌细胞的体外实验结果表明，LH-RH 可以作为多肽配体，用来靶向各种表达有LH-RH受? 体的肿瘤细胞，如乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、子宫内 膜癌细胞及前列腺癌细胞等，从而更好发挥抗癌药 物的疗效，达到显著抑制肿瘤细胞增殖的效果。对 3种卵巢癌细胞株UCI-107、0V-1063和ES-2以不 同作用的方式给药，体内实验结果显示，靶向蛙皮素? 的复合物(AN-215)、靶向生长抑素的复合物(AN- 238)和靶向黄体酮释放激素的复合物(AN-207)单 独给药都具有明显的抑制卵巢癌细胞生长的作用， 同时这些化合物并没有诱导耐药基因的表达。将? AN-215+AN-238和AN-207+AN-238 以相同剂量? 联合给药时，AN-215+AN-238对UCI-107肿瘤的体 积和重量减少分别为：46.2%、44.2%;AN-207+? AN-238减少OV-1063和ES-2肿瘤体积和重量分别 为：58.1%、69.1%,53.5%、25.79%。说明更多的? 实体瘤细胞上受体的表达多样化，各种多肽复合物 的联合治疗可能抑瘤效果更好。Keller等[9通过对 人类肾细胞肿瘤进行免疫组织化学分析，对3种肾? 癌细胞株A-498、ACHN和786-0进行了放射性受 体测定和免疫印迹及逆转录PCR分析。结果表明， 3种肾癌细胞株都有高表达LH-RH受体。体内实 验发现AN-207对3种肾癌细胞的肿瘤体积抑制作 用达67.8%～73.8%,对肿瘤重量的抑制作用为 62.2%~77.3%,而游离的AN-201则没有显著抑瘤 效果。如果使用过量的LH-RH激动剂6-D-色氨酸 戈那瑞林封闭LH-RH受体，AN-207则无显著抑瘤? 效果。这说明了AN-207是通过配体-受体结合的方 式发挥抑瘤作用的。

　　5? 其他肽类介导的靶向药物递送系统

　　5.1 前体药物递送系统

　　癌症治疗的一个关键问 题是目前抗癌药物对于癌细胞的选择性较差。克服 这个问题的一个可行性方法之一是设计抗癌的前体 药物。由于蛋白质药物在穿越生理膜屏障(如胃肠 屏障、血脑屏障等)的过程中具有水溶性低、稳定性 差及渗透性差等缺点，从而阻碍了它的应用。最近研究表明，通过使用前体药物，可有效地克服以上缺 点。Denmcade等[10将一种前列腺特异性抗原 (PSA)蛋白酶的底物作为载体，与经过修饰的毒胡 萝卜素内酯L12ADT结合，产生了一个可溶的、可穿 透细胞膜的前药。通过对由PSA诱导产生的 LNCaP前列腺癌细胞株和非PSA诱导产生的HCT- 116结肠癌细胞株进行体外实验。动力学结果表 明，该前药能被PSA水解，靶向由PSA产生的前列 腺癌细胞，包括迁移了的前列腺癌细胞，而且在人血 浆中非常稳定。体内实验对接种由PSA产生的 LNCaP前列腺癌细胞的小鼠静脉注射该前药，能显 著抑制癌细胞的生长，肿瘤细胞体积减少了55%, 当连续皮下注射时能完全抑制癌细胞的生长，对非 PSA产生的前列腺癌细胞却没有作用。

　　5.2 基因递送系统

　　基因治疗成功的关键是如何 将目的基因有效地释放到靶细胞中，这一点依赖于 高转染效率和特异靶向性的载体。目前基因载体主 要分为病毒载体系统和非病毒载体系统。其中，非 病毒转基因载体虽然转染效率相对于病毒载体而言 较低，但因其具有携带目的基因容量大、低免疫原 性、无恶性转化可能以及易于大规模制备等优点而 受到瞩目，其中包括小分子多肽。

　　Pan[Ⅱ]等经实验证明一种包含了RGD的寡肽 (K)?GRGDSPC是一种易合成的、高效无毒的载体， 它可以把外源性的基因靶向转入小鼠的骨髓基质细 胞(BMSCs) 内。发现寡肽(K)6GRGDSPC 的转运效 率在氯奎或聚乙烯亚胺存在时极大地增加。实验结 果说明，寡肽(K)6GRGDSPC是一种理想的、靶向的 非病毒基因载体。

　　5.3? 形成免疫交联物

　　Szynol等[12]筛选出了 dhvar5,一个来源于富组蛋白，含有14个氨基酸的 人工合成小分子肽，具有高度疏水的氨基末端及带 阳离子羧基末端，既亲水又亲脂的性质。利用重组 DNA技术将合成的抗微生物肽dhyar5和一种重链 抗体VHH进行DNA重组，形成了免疫交联物 VHH-dhvar5,为了提高体内活性肽的释放，在VHH 和dhvar5之间插入了Xa因子切割位点，这种重组 肽通常都是很稳定而又能很快被降解。因为抗微生 物肽通常对宿主组织都有毒性，所以常常被制成融 合蛋白。与抗体融合可以稳定抗微生物肽，能靶向 到达病变组织。

　　最近从噬菌体肽库中筛选出一类含谷氨酸(E) 和精氨酸(R), 即ER模序(-ECLRSVVTC-) 的多肽， 能够与TF胞外区紧密结合但不会激活F VⅡI引发外源性凝血。实验针对TF设计合成一种多肽，作 为靶向抗癌药物的载体，命名为FHS001。Xiang 等[13]采用固相法设计、合成能与组织因子(TF)特 异性结合的配体分子FHS001,通过异型双功能交联 剂Sul-f0-SANPAH,将FHS001与Cenistein交联，制 备了Genistein靶向多肽偶联物GEN-P。荧光显微 镜直接检测其与高表达TF的人乳腺癌细胞株MCF- 7的结合。结果表明，合成的FHSO01多肽能与高 表达TF的MCF-7细胞特异性结合且无明显的凝血 活性。MTT法检测其对MCF-7的杀伤作用。结果 表明，GEN-P偶联物在0.2～200 μmol ·L-'内对 MCF-7细胞均有不同程度的增殖抑制作用，作用6h 后抑制率为16.3%~83.1%,且呈一定的剂量依赖 性。GEN-P和Genistein对MCF-7细胞的ICs 。分别 为2.0和120 μmol ·L-',GEN-P效果明显优于游 离药物Genistein。

　　5.4? 形成脂质体

　　脂质体(liposome)是磷脂分散 在水中时形成的脂质双分子层，其内部为水相的闭? 合囊泡。近年来，脂质体制剂技术迅速发展并逐渐? 完善，国内外学者将其广泛应用到蛋白质、多肽和? 多糖等 一 些生物活性大分子药物的研究中。由于? EPR效应，脂质体有一定的被动靶向作用，但是脂? 质体本身无特异靶向性。在脂质双层中掺入对特定? 细胞具有选择性和亲和性的配体，利用细胞对配体? 的识别可得到专一性地作用于靶细胞的靶向脂质体。Maeda等[4分离出Ala - Pro - Arg - Pro - Gly(APRPG), ?? 能特异性结合于肿瘤新生血管。体内实验表明，用 APRPG修饰的包载DOX的脂质体能够显著抑制肿? 瘤生长，延长存活时间达到74 d。用APRPG修饰的? 脂质体稳定，粒径在120～170 nm且近中性，在血中? 无明显聚集。对于高表达血管内皮生长因子的人脐? 静脉内皮细胞有显著亲和力。而对于不表达血管内? 皮生长因子的结肠癌细胞C26 NL17则几乎没有亲? 和力。肿瘤的新生血管是肿瘤生长、增殖和转移的? 关键性因素，应用APRPG修饰的脂质体针对肿瘤新? 生血管进行的抗肿瘤血管新生疗法几乎可以主动靶? 向到所有的实体瘤，而且不会产生药物耐受，是一种? 新型、高效的抗肿瘤方法。

　　6 展望

　　小肽具有低毒性、靶向性、无免疫原性、良好的 生物相容性、可降解性及本身的治疗作用等特点，在 不同肽类受体介导的药物递送中的作用受到越来越 多的关注，同时也取得了很大的研究进展。多肽分 子生物活性的研究和受体不断的发现为肿瘤的诊治开辟出新的途径，显示了良好的研发应用前景。抗 肿瘤多肽的研究目前国际上还处于起步阶段，在 DDS方面的发展也存在着一些制约因素，如肽类难 以预料的翻译后修饰及前体肽被剪切的位点不确定 性，筛选和纯化较复杂；应用广泛的化学药物与肽类 载体需要化学键的结合，还需要“间隔臂”结构作为 桥梁作用的间接参与，某些LH-RH复合物合成后对 同分异构体的分离纯化，使化学反应的难度增加而 产率减少。另外，肿瘤细胞表面受体表达的复杂性 和多样性也是制约短肽在药物递送系统中应用的原 因之一 ；肽类在药物递送系统中的作用需要更多的 体内数据对其作用机制进行深入的阐述，寻找或发 现新型高活性多肽。