步步惊心，难怪我的核酸提取总是不成功

　　微生物学是一个很难找到自己身份的领域。作为发展迅速的研究领域之一，它帮助我们更好的理解了自身的健康和周围的环境。然而，它的流行程度已经超过了方法论。现在，该领域的研究人员已经认识到有偏倚的数据会导致不准确的微生物分析，并正在寻找提高微生物组研究准确性的最佳方法。随着该领域的进展，一个大问题仍然存在：研究人员如何解决方法学上的偏倚？

　　从样品到提取分析的环节中，有哪些方面值得我们的注意，本文将会为你一一解答，防止落入陷阱。

　　样品的保存

　　

　　由于处理和存储样品的变化会影响研究结果，因此要想维持在现场收集样品的完整性也是微生物研究中的一项重大挑战。来自 Mayo 医院的微生物生态学家 Vanessa Hale 表示，金标准方法是从新鲜样本中立即提取 DNA 或 RNA。当不可能立即处理的时候，最好能将样品储存在 ?80 °C。

　　室温下粪便样品中的微生物组成会在一到两天内发生转变，其它样品，如土壤也同样具有温度敏感性。但是超低温冰箱并不是随取随到的，也许粪便样本首先在家里收集得到，或者研究人员需要从很远的地方收集土壤样品。在一些情况下，样品都需要存储和保留几天或几周，才能进行 DNA 和 RNA 的提取和分析。

　　「微生物多样化多到可怕，而且复杂。任何特殊处理都会改变其组成部分。」不过随着技术发展，现在可以进行更多深入的微生物群落分析，即使是微生物菌群最小的变化或者相对丰度改变，也会极大的干扰群体比对，因此储存方法引起的变化越小越好。

　　Zymo research 研发的 DNA / RNA Shield? 可以完整的保留微生物多样性,防止衰变。DNA / RNA Shield? 无缝兼容下游 DNA/RNA 提取方法和产生最高的收益率。

　　

　　洁净的操作环境

　　为了确保成功，提取到未受污染的微生物关键一步是在适当的环境中工作，例如封闭的工作站或洁净室。 细菌可以在各种表面上存活，微量的 DNA 可以在任何时间和任何地方存在。 请记住，您正在实验室环境中工作，其中存在扩增子，特别是用于微生物组学分析的扩增子。 确保每个环节都有一个单独的工作空间，并充分清洁表面。清洁的工作环境对于最大限度地减少生物负载至关重要。

　　DNA/RNA 提取

　　除了在适当的环境下工作外，在微生物组研究中，使用经认证的低生物负载 DNA/RNA 提取试剂盒和试剂对减少生物污染也很重要。在提取和文库制备过程中，特别注意防止引入污染的核酸和微生物也是关键。使用低生物负载试剂和谨慎的操作将有助于防止污染物的引入，这些污染物可能会改变您的样品微生物特性。

　　在提取核酸时使用清洁生产程序，如果使用试剂盒，请使用经过认证的低生物负载试剂盒，如 ZymoBIOMICS DNA 试剂盒。这些试剂盒专为使用高灵敏度、低生物量样品的用户设计，以确保对细菌背景核酸的污染最小。确保用于机械裂解的珠子是不含污染物。ZymoBIOMICS 提取试剂盒中使用的 ZR BashingBead 管是高压灭菌的，裂解珠在高温下（250 °C 高温 5 小时）烘烤，以降解任何污染的细菌 DNA，小心确保在处理过程中样品之间没有交叉污染[1]。

　　

　　

　　研究人员真正想要的是：

　　标准化的方法

　　

　　转化微生物组研究中心（CTMR）的研究人员认识到，不正确的样本采集和存储会导致微生物组研究中的种群层次严重偏差和不准确的结论。在最近的一项研究中，他们测试了微生物组样品保存，提取和测序的各种策略，以便标准化此类研究的正确做法。

　　使用 ZymoBIOMICS 微生物群落标准品

　　ZymoBIOMICS 微生物群落和 DNA 标准品可作为评估微生物组学工作流程的标准。该标准的目的是为了帮助评估微生物菌群构成的准确性。它们有两个主要的应用：

　　（1）建立和优化准确、可靠的微生物学工作流程；

　　（2）建立微生物学工作流程的日常质量控制。

　　

　　ZymoBIOMICS 微生物群落标准品

　　如何去除宿主 DNA 进行

　　微生物组分析

　　微生物组学对我们越来越重要，生活在人体内和身体上的微生物时刻都在影响我们。而用鸟枪测序评估人类微生物组的主要挑战是存在「污染」微生物组样品的人类宿主 DNA。

　　采用减法运算的加法

　　为了克服宿主 DNA 污染的挑战，Zymo Research 使用 HostZERO 微生物DNA试剂盒重新设定了 DNA 提取过程。该宿主 DNA 去除试剂盒使用一种新方法，通过在总 DNA 纯化之前选择性裂解人类细胞并降解该 DNA 来减少污染宿主 DNA 的量。HostZERO 微生物 DNA 试剂盒配合最精确的纯化技术，可确保从生物样品中的微生物中特意捕获 DNA。

　　这项新技术将唾液样品中人类 DNA 的存在从未处理样品中的 64.5％ 减少到处理样品中仅 0.8％[2]。此外，HostZERO 技术可以纯化保留细菌 DNA，而不会偏向容易裂解的细胞。随着宿主 DNA 的和纯化中的偏倚减少，HostZERO 微生物 DNA 去除试剂盒通过允许更多的测序读数集中于微生物 DNA 来增强 WGS（全基因组测序） 的能力。

　　随着 WGS 的价格持续下降，越来越多的微生物组分析项目正在转向宏基因组测序，以揭示环境甚至临床样本中的微生物物种。但是，如果不进行额外的标准流程建立，则会浪费更多宝贵的资源。

　　相关产品信息

　　产品

　　货号

　　规格

　　ZymoBIOMICS? DNA/RNA Miniprep Kit

　　R2002

　　50 preps

　　ZymoBIOMICS? 96 MagBead DNA/RNA Kit

　　R2135

　　1 x 96 preps

　　ZymoBIOMICS?Microbial Community Standard

　　D6300

　　10 preps

　　DNA/RNA Shield

　　R1100-50

　　50 mL

　　DNA/RNA Shield? – Blood Collection Tube

　　R1150

　　50 tubes

　　DNA/RNA Shield (2X Concentrate)

　　R1200-125

　　125 mL

　　HostZERO? Microbial DNA Kit

　　D4310

　　50 preps

　　部分使用过以上产品的机构：

　　

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　　内容审核：刘果、康晋伟

　　图文来源：天漠生物

　　题图来源：站酷海洛

　　参考文献：

　　[1]. Ducarmon Q R, Terveer E M, Nooij S, et al. Microbiota-associated risk factors for asymptomatic gut colonisation with multi-drug-resistant organisms in a Dutch nursing home[J]. Genome medicine, 2021, 13(1): 1-17.

　　[2]. Belkova N, Klimenko E, Vilson N, et al. Metagenome datasets from women with polycystic ovary syndrome from Irkutsk, Eastern Siberia, Russia[J]. Data in brief, 2020, 32: 106137.