使用方法丨艾美捷Caspase

　　如何动态检测活细胞内的Caspase-1的活性，做更真实的实验？艾美捷推荐Immunochemistry Tech（ICT）的FLICA系列科研工具，轻松检测活细胞Caspase-1 活性。

　　艾美捷Immunochemistry Caspase-1活性分析试剂盒原理：

　　FLICA试剂FAM-YVAD-FMK（Ex/Em = 488nm/530nm），是无细胞毒性的，细胞膜渗透抑制剂。进入每个细胞，并不可逆地与活化的caspase-1结合。任何未结合的FAM-YVAD-FMK-FLICA试剂扩散出细胞并被冲走。因此留在细胞内的绿色荧光直接体现了活性caspase-1酶活性的。荧光结果可通过荧光酶标仪、荧光显微镜、流式细胞仪进行分析。

　　艾美捷Immunochemistry Caspase-1活性分析试剂盒组分：

　　

　　推荐的材料：

　　?DMSO，每小瓶50μL，用于重建FLICA

　　?DiH20，135-540 mL，稀释10X凋亡洗涤缓冲液

　　?磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4，最高100mL，稀释FLICA并处理细胞

　　?处理细胞时，将FBS和/或BSA添加到缓冲液中

　　?在实验条件下处理的培养细胞或组织可随时标记

　　?诱导胱天蛋白酶活性并产生对照品如星孢菌素（#6212），喜树碱（#6210）或尼格瑞林（#6698)

　　?90%乙醇或3%甲醛，产生活/死碘化丙啶染色对照

　　?黑色96孔微量滴定板，平底，未处理，非无菌（ICT目录#266）。如果使用底部读数仪器，使用黑色板墙壁和透明的底部。如果在使用无菌黑色组织培养板。

　　?血细胞仪

　　?200 x g离心

　　?15 mL聚丙烯离心管（每个样品）

　　Caspase-1活性分析试剂盒检测设备：

　　可通过以下方法分析分析：

　　?荧光显微镜

　　?荧光板读取器

　　?流式细胞仪

　　使用最接近这些设置的过滤器对：

　　?FAM-FLICA最佳激发波长为488-492 nm，峰值发射波长为515-535纳米。

　　?在长通滤波器下观察碘化丙啶（PI）488-492nm，发射>610nm；核结合PI在617nm处具有最大发射。

　　?使用365 nm激发的紫外滤光片可以看到Hoechst 33342以及480nm的发射。

　　实验准备：

　　用FLICA染色细胞可以在几个小时内完成。然而FLICA用于活细胞，需要定期维护和提前几天栽培。此外，一旦正确的数字已经培养了个细胞，必须为实验分配时间治疗或半胱天冬酶激活过程。创建细胞群，例如：

　　a、 暴露于实验处理的细胞

　　b、 接受安慰剂的阴性对照细胞群

　　当FLICA检测到催化活性形式的胱天蛋白酶时酶，计划实验，以使FLICA在细胞中预期胱天蛋白酶被激活时被稀释和给药。30X FLICA的推荐体积为每300μL细胞10μL3-5 x 105细胞/mL，但数量可能因实验而异条件和用于分析的仪器。每位研究者应调整FLICA的量以适应特定细胞系研究条件。将细胞培养至适合特定实验条件的最佳密度或凋亡诱导方案。细胞密度不应超过106细胞/超过此浓度培养的细胞可开始自然生长进入凋亡。可能需要进行初步实验来确定何时以及使用多少FLICA作为产生的正信号是培养过程中caspase活性的直接测量。

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