单克隆抗体发展史

　　来源：体外诊断技术支持

　　抗体的发现

　　抗体由B淋巴细胞产生, 可以特异性结合病原抗原并阻断病原侵染。1890 年, 德国生理学家Emil von Behring 和日本微生物学家Shibasaburo Kitasato在暴露于白喉毒素和破伤风毒素的动物血液中发现一种可以中和毒素的物质, 并将其命名为抗体(antibody)。

　　他们引入“抗体”一词来泛指抗毒素物质，在医学实践中, 抗血清一直被用于传染病的被动免疫疗法或者检测工具。然而, 由于血清抗体的多克隆性及效价不稳定, 这些方法的效果不一, 还常受到过敏反应和血液传播病原体风险增加等问题的限制。

　　同时，与他们合作的德国科学家Paul Ehrlich受当时关于酶与底物结合的“锁钥学说”启发, 提出抗体与毒素抗原相结合也是基于类似的化学结构原理。20 世纪20 年代, 美国免疫化学家Michael Heidelberger 和美国微生物学家Oswald Avery发现抗原可以被抗体沉淀,并揭示抗体的化学本质是蛋白质。 1948 年, 瑞典免疫学家Astrid Fagreaus发现由B 细胞分化而成的浆细胞是产生抗体的效应细胞。

　　自被发现开始,抗体便成为了科学界一个经久不衰的研究热点。人们发现, 抗体在适应性免疫(adaptive immunity)中发挥着不可替代的核心作用, 并惊讶于抗体对各类抗原(antigen)分子兼具高度亲和力及高度特异性的结合能力。

　　然而, 想要得到识别特定单一抗原的抗体十分困难。以当时的技术, 人们希望获得可以特异性识别流感病毒的抗体, 就需要用灭活的流感病毒来免疫模式动物(例如小鼠或兔子), 一段时间后从被免疫动物的血清中分离抗体。

　　由于血清中大量不同抗体的存在, 这样获得的抗体成分中能够特异性结合流感病毒的一般只有0.5%~5%, 不仅特异性低, 而且可重复性也难有保障。即使使用亲和层析技术也无法纯化流感病毒特异性的抗体, 因为亲和层析无法分离针对同一抗原不同表位(epitope)的抗体。

　　这样纯化出来的抗体也会是成千上万种针对不同表位抗体的混合物, 也就是所谓的多克隆抗体(polyclonal antibody)。这种多克隆抗体在科研临床应用有限。

　　单克隆抗体的诞生

　　20 世纪60 年代, 多发性骨髓瘤(multiple myeloma)被人们发现。作为一种浆细胞来源的肿瘤, 它在人体内可不受控制地无限增殖。

　　由于骨髓瘤细胞保持了浆细胞高效率分泌抗体的特性, 因此多发性骨髓瘤患者的血清和尿液中可以检测到大量被称为paraprotein 的抗体和抗体片段(多为IgA、IgG、λ 轻链和κ 轻链)。

　　研究者利用骨髓瘤细胞的这一特点对抗体进行了更深入的研究, 虽然这些抗体还并非是针对单一抗原表位的单克隆抗体, 但是人们借此对抗体的生化基础有了更深的了解。

　　肿瘤免疫学家MichaelPotter 发现, 在特定品系的小鼠体内注射矿物油可以诱发小鼠产生骨髓瘤,这为骨髓瘤和抗体研究提供了动物和细胞模型。

　　1974 年, 毕业于瑞士巴塞尔免疫学研究所(Basel Iustitute for Immunology)的K?hler 作为一名博士后加入了Milstein在剑桥大学的实验室。当时细胞融合技术正热门, Milstein的团队尝试在一些小鼠骨髓瘤细胞系以及各种其他细胞(例如成纤维细胞)之间进行细胞融合。

　　然而细胞融合后杂交细胞分泌的抗体特异性不佳。恰好K?hler 在巴塞尔免疫研究所攻读博士时了解到, 当时的研究所所长Niels Jerne 开发了一种可以筛选分泌单一抗体浆细胞的方法,即通过含有绵羊红细胞(sheepred blood cell, SRBC)的琼脂平板上的斑块(plaque)来筛选分泌针对SRBC单一抗原抗体的浆细胞。

　　分泌识别SRBC 抗体浆细胞团簇周围的红细胞会因为抗体结合后的作用而发生细胞裂解, 从而形成一块肉眼可见的没有红色斑块的区域。但是由于缺乏永生性,这些能够分泌单一性抗体的浆细胞无法被培养, 进而无法实现抗体的大规模生产。

　　因此, K?hler 和Milstein 想到, 如果能够将分泌单一抗体的浆细胞和无限增殖的骨髓瘤细胞融合, 就可以一举解决稳定持续大量地生产单一性抗体这一难题。

　　K?hler 和Milstein 的实验设计获得了成功——当他们把注射了SRBC 的小鼠脾脏细胞取出, 与P3-X67Ag8骨髓瘤细胞系融合, 并在含有SRBC 的琼脂平板上培养后,在没有红色斑块的区域分离出了大量既像浆细胞一样分泌抗SRBC 抗体又像骨髓瘤细胞一样具有永生性的融合细胞。

　　在他们使用的HAT 培养基中, 由于氨基蝶呤(aminopterin)阻断了DNA 核苷酸的从头合成途径, 细胞必须利用自己的DNA 核苷酸补救合成途径以及培养基中的次黄嘌呤(hypoxanthine)和胸腺嘧啶(thymidine)才可以生存。

　　但是这里使用的骨髓瘤细胞系缺少DNA 补救合成途径中的必要酶, 即次黄嘌呤- 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthineguanine phosphoribosyltransferase, HGPRT), 因此无法正常增殖, 脾脏细胞则本身不具有永生性。

　　这样, 能够在他们设置的培养条件下正常增殖的细胞, 必然是既拥有HGPRT, 可以正常合成DNA, 又具有无限分裂特性的融合细胞。当然他们这样设计的实验能够成功, 有一定运气,后来人们知道骨髓瘤细胞明显倾向于和脾脏细胞融合, 而不是发生自体融合。

　　K?hler 和Milstein 培养出的融合细胞被称为第一代杂交瘤(hybridoma)细胞, 可以进行无限的培养、增殖和抗体分泌。但是在技术层面, 由于他们当时使用的P3-X67Ag8骨髓瘤细胞系会内在性地分泌自身基因组编码的抗体, 因此第一代杂交瘤细胞分泌的浆细胞来源特异性抗体中会掺杂骨髓瘤来源的非特异性抗体。

　　不过很快地, 一类不会内在性地分泌骨髓瘤来源非特异性抗体的X63-Ag8.653 骨髓瘤细胞系被免疫学家Rajewsky 的研究团队成功分离。使用X63-Ag8.653 骨髓瘤细胞跟来自脾脏的浆细胞进行融合,很好地解决了第一代杂交瘤细胞培养上清中两种抗体混杂的问题。

　　从此,可以高度特异性结合人们需要的各类抗原的单克隆抗体终于可以在体外被制造出来, 并在实验室研究和医疗应用中得到了极大的应用。 1984 年, Milstein、K?hler 和发现骨髓瘤诱导产生方法的Potter 被授予生物医学领域知名的拉斯克奖, 同年的诺贝尔生理学或医学奖则被颁给Milstein、K?hler和发明平板筛选SRBC 特异性抗体方法的Jerne。

　　

　　非常值得一提的是,剑桥大学Milstein 实验室在单克隆抗体技术投入应用后毅然放弃了这些技术的专利权, 使得全世界的研究者和病人不需要支付额外的专利费用就可以享受使用单克隆抗体技术生产的试剂和药品。

　　为此,Milstein 曾说过, “只有当世界上真正穷苦的人们也能平等地分享科学带来的好处时, 科学才算是兑现了它的诺言”。 Milstein 的义举, 在物质至上的社会, 也的确引起一些争议。

　　后来有推测或许是因为Milstein出生于1927 年社会动荡的阿根廷,这些成长早期的社会经历使得Milstein真正理解并不宽裕的广大人民群众对科技进步带来的相关成果的急迫需求。

　　

　　自小鼠杂交瘤技术诞生以来,单克隆抗体技术在过去45 年间取得了长足的发展。其中, 最显著的是多种各具特色的抗体筛选技术的出现, 为制备单克隆抗体提供了更多的选择。此外, 强烈的临床需求还催动了更高效的以人源抗体为目标的单克隆技术的发展。

　　抗体筛选技术：噬菌体展示技术

　　噬菌体展示技术作为第一种可以高通量筛选对特定病原体反应抗体的创新方法, 其主要技术流程包括: 从被免疫或感染后的人体外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcell, PBMC)提取细胞总RNA, 并反转录成cDNA; 通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片段, 随后将扩增的基因片段随机克隆形成组合文库; 将组合文库导入丝状噬菌体(filamentous bacteriophage)与外膜蛋白融合表达; 用固相化抗原直接、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体基因序列, 经体外加工形成全人源抗体。

　　这个技术为抗体定向演化提供了全新策略, 从根本上改变了传统杂交瘤技术制备流程, 一次筛选可获得针对同一抗原不同表位的多种抗体, 缩短了实验周期并增加了稳定性。因此, 噬菌体展示技术于2018年被授予诺贝尔化学奖。

　　但该技术也有明显缺点: 它对抗体蛋白的修饰和折叠与人体细胞差别很大, 一定程度上影响了抗体的亲和力。因此, 噬菌体展示技术获得的抗体往往还需要人工优化。

　　抗体筛选技术：酵母展示技术

　　酵母展示技术实现了从原核表达系统到真核表达系统的进步。酵母菌具有折叠酶、分子伴侣、内质网等, 在蛋白质的折叠和分泌机制方面与高等哺乳动物相似, 基于此建立起来的酵母表面展示技术可用于展示糖基化和二硫键异构化等修饰的真核生物蛋白质, 有助于提高展示抗体的稳定性和抗原结合能力。

　　并且, 利用流式细胞技术还能对表达抗体的酵母颗粒进行分选, 达到高效、快速的筛选和分离。不过酵母的蛋白质修饰系统与人体依然有不小的差异, 这对抗体功能仍存在一定影响。

　　抗体筛选技术：哺乳动物细胞展示技术

　　中国仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary, CHO)细胞是目前用于真核基因表达的最成功的哺乳动物细胞, 在生物工程上被广泛应用。与噬菌体展示技术相比, 外源蛋白更易在CHO 细胞中合成并分泌到培养基; 重组蛋白能够正确折叠、修饰、组装多亚基蛋白, 并且其理化性质、生物学性质几乎与天然蛋白相似, 这在生物技术的发展中具有很高的应用价值。但外源基因在CHO 表达系统中的表达效率比在酵母展示系统中低且重组蛋白的生产成本较高。

　　抗体筛选技术：核糖体展示技术

　　核糖体展示技术由Plückthun 实验室于1997 年建立。该技术通过PCR 扩增淋巴细胞cDNA 中的VH 和VL 基因并引入体外表达元件方式构建文库, 然后在体外无细胞体系中转录和翻译。

　　由于构建模板时3′端序列不含有终止密码子, 因此体外翻译时核糖体停留于mRNA 的3′端, 使文库基因的翻译产物展示在核糖体表面, 形成“蛋白质-核糖体-mRNA”三元复合物。

　　最后用靶抗原反复筛选复合物、分离mRNA、逆转录富集目的基因, 从而获得特异性的单克隆抗体序列。与其他展示技术相比, 核糖体展示具有建库简单、库容量大、分子多样性强、筛选方法简便、无须选择压力, 还可通过引入突变和重组技术来提高靶标蛋白的亲和力等优点, 是一种筛选大型文库和进化抗体强有力的方法。如何进一步提高该系统的稳定性, 防止mRNA 降解, 则是该技术需要解决的关键问题。

　　抗体筛选技术：单细胞抗体基因扩增技术

　　2008 年, Tiller 等人发明了一种从人外周血单个核细胞快速制备单克隆抗体的方法。其主要过程包括: 经流式分选出抗原特异性单个B 细胞, 单细胞RT-PCR 与巢式PCR 组合获取抗体重链和轻链的可变区基因信息, 将这些基因克隆并在真核系统中表达。

　　单个B 细胞的分离可以分别通过“随机分选”或者“抗原特异性分选”两种途径进行。“随机选择”的主要方法有基于显微操作的细胞分选、流式细胞分选技术等。“抗原特异性分选”的主要方法有抗原包被的磁珠分离、荧光包被的抗原多参数流式细胞分选等。此外, 近年来快速发展的单细胞测序技术使得研究人员能够更低成本、更大规模地获得B 细胞抗体基因。

　　同时, 细胞微阵列芯片、显微雕刻技术和免疫斑点阵列芯片技术也为高通量筛选单克隆抗体分泌细胞提供了条件。与各种抗体展示技术相比, 单细胞抗体基因扩增技术能快速、直接地获得人源抗体, 特别适合在突发传染病等情况下发现有保护性的单克隆抗体。

　　人源抗体技术：嵌合抗体和人源化抗体

　　由于通过小鼠杂交瘤技术制备的单克隆抗体是非人源性的, 应用于人体不可避免地会引起人抗鼠抗体反应,导致药物疗效降低, 或者引起过敏反应, 甚至威胁生命,限制了单克隆抗体的临床应用。

　　为了克服这种缺陷, 20世纪80 年代中期, 研究者们寻求以基因工程技术对鼠源性单克隆抗体进行改造优化, 尝试对其进行人源化处理。如将鼠源抗体可变区与人抗体恒定区拼接而形成“嵌合抗体”, 或将鼠抗体可变区的互补决定区(complementarity determiningregion, CDR)与人抗体的互补决定区互换构成“人源化抗体”。

　　“嵌合抗体”的人源程度可达60%, “人源化抗体”可达90%~95%。这虽然在极大程度上保持亲本抗体的特异性和亲和力, 但仍不是真正意义上的人源抗体,仍无法完全避免进入人体后发生排斥反应或超敏反应。

　　

　　人源抗体技术：抗体基因人源化小鼠

　　虽然各种抗体展示与筛选技术为制备人源单克隆抗体提供了选择, 但是由于展示文库多样性不足或者抗原使用等方面因素的限制, 获得理想抗体特别是高亲和力单克隆抗体的效率仍然偏低。

　　直接由人B 细胞构建抗体基因人源化小鼠, 并通过自然筛选过程产生高亲和力人源抗体是正在发展中的技术变革, 有望成为最具优势的抗体药物研发平台。该技术需要将小鼠抗体基因替换成相应人抗体基因, 并且通过正常的抗体基因重排与克隆选择过程发育出表达人源抗体的B 细胞。

　　目前, 构建这种人源化小鼠的基本方法是在鼠胚胎干细胞(embryonicstem cell, ESC)中进行同源重组使得鼠原有抗体基因缺失,破坏其免疫系统,再通过显微注射、逆转录病毒载体、酵母人工染色体系统或者精子介导外源DNA转移等技术将重建的人源抗体胚系基因位点转入小鼠体内,最终由杂交瘤技术或者抗体库技术筛选出靶向的单克隆抗体。

　　HuMAb-Mouse 与XenoMouse 是目前最为成熟的转基因小鼠技术平台。由于人源化小鼠的抗体是在体内产生, 经历正常发育和成熟过程, 其产生的抗体相对于其他技术具有较高的靶结合亲和力。

　　但是, 该技术尚存在不足之处, 包括由于仅导入部分人源基因引起的抗体多样性低, 对小分子化合物免疫原性较弱, 不适合针对生物毒素等对机体有害的人源抗体的制备以及所制备的抗体含有鼠糖基化修饰等。

　　

　　单克隆抗体在基础研究中的应用

　　K?hler 和Milstein 的发现创立了具有划时代意义的单克隆抗体技术, 对生物医学的影响是巨大的。单克隆抗体在研究中主要用于两个方面: 第一,用于研究抗体本身的性质及其产生的机理;第二, 用于生产与特定蛋白质或其他特定分子结合的试剂。

　　在第一方面,相比之前无法确保同质性和特异性的抗体制备, 使用新技术生产的高纯度、高浓度的单克隆抗体自然对抗体特异性的研究有更大的帮助。此后不久, 人们便发现抗体的可变区(V)和恒定区(C)是由不同的基因片段编码的。

　　B 细胞将这些基因片段连接在一起, 便形成了识别不同抗原的抗体。其中具有结合抗原能力的抗体可变区,其基因片段会进行高达1012 种可能性的重组, 抗体库的多样性由此产生。

　　另外由于抗原刺激介导的体细胞超突变(somatic hypermutation)使得抗体应答进程中抗体亲和力不断提高, 也就是抗体亲和性成熟(affinity maturation)。单克隆抗体技术推动了在分子层面阐释抗体产生的分子机理。

　　此外, 由于抗体在免疫系统中的核心地位, 单克隆抗体技术的出现, 也让人们对获得性免疫和体液免疫有了更进一步、更深层次的了解。

　　在第二方面,单克隆抗体技术提供了对生物大分子(主要是蛋白质)进行准确定性、定量、定位的手段, 如今已经渗透到生物医学研究的各个方面, 诸如通过细胞表面蛋白标记对细胞进行分类筛选分析的荧光细胞分选技术、展示细胞内特定蛋白定位的高分辨率荧光显微镜、检测蛋白质混合物中特定蛋白表达量的蛋白印迹法(Western blot)、常用于血清中细胞因子表达量测定的酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbnent assay, ELISA)等, 这些技术的特异性和分辨率都离不开高质量的单克隆抗体试剂的助力。

　　值得一提的是, 得益于荧光标记单抗的发展, 我们现在已经能够在单细胞水平对细胞表面的蛋白质标志物表达图谱进行高通量的绘制与分析。

　　单克隆抗体在医药领域的成功

　　尽管早期对抗体的产生和作用机制了解得并不透彻, 但是自从被发现以来, 抗体就被医学界和工业界应用于早期的血清疗法、疾病诊断等多个方面。单克隆抗体技术的出现, 更为抗体类药物的发展插上了腾飞的翅膀。

　　1986 年, 仅仅在单克隆抗体制备技术诞生10 年后, 美国FDA 就批准了全球首个治疗性鼠源单抗, 一种名为muromonab-CD3 的抗CD3 抗体, 用于治疗器官移植后同种异体排斥反应。

　　随后几十年, 单克隆抗体类药物在生物医药领域得到了飞跃式发展, 如今已经有约千亿美元的巨大市场, 并且在可预见的未来仍将继续增长, 再加上抗体在疾病诊断上难以替代的地位, 单克隆抗体在医药领域的应用可谓是公认的成功。

　　最初,把来源于小鼠的单克隆抗体用于人类疾病治疗,但在人体内半衰期短且引发免疫排斥风险等问题, 效果并不好。这是因为人体的免疫系统会把小鼠的抗体蛋白识别为“异己”成分, 并产生针对小鼠抗体的抗体; 但小鼠抗体的恒定区段无法和人类细胞的新生Fc 段受体(FcRn, 也被翻译为滋养层细胞表面相应受体)结合, 从而难以在人体循环系统中稳定存在。

　　为解决这个问题, 1988 年, Greg Winter 团队首先发展了人源化嵌合单克隆抗体。他们将抗体基因中与特异性无关的恒定区替换为人类抗体的同源区段, 在没有丧失特异性的前提下提高了单克隆抗体药物在人体内的稳定性, 这是单抗临床应用领域的重要进步。

　　人源化嵌合单克隆抗体并不完美, 因为对人体的免疫系统来说, 毕竟嵌合的抗体分子中仍有非人源成分, 人体强大的免疫系统依然能够识别它们并产生针对嵌合抗体的抗体。为了进一步减少单克隆抗体中的鼠源成分, 研究者们索性将鼠抗体上的超变区氨基酸结构域直接移植至人源的抗体分子, 从而改良出比嵌合抗体更先进一步的、分子结构同源性达到95%的人源化抗体。

　　即使如此, 鼠源抗体的Frame Region 还是无法彻底的人源化, 但是人类追求卓越的脚步并未停止。随后不久, 借助分子生物学及基因工程技术等的快速进步, 噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术、RNA-多肽融合技术和人类抗体库转基因小鼠制备技术的发展最终实现了全人源化抗体的飞跃 。

　　在肿瘤与自身免疫性疾病治疗方面, 单克隆抗体获得的成功尤其令人瞩目。现在临床上使用的利妥昔单抗(Rituximab)就是一种抗CD20 人-鼠嵌合性单克隆抗体, 也是第一个被批准用于肿瘤治疗的单克隆抗体, 主要应用于B 细胞非霍奇金淋巴瘤。

　　利妥昔单抗能够显著延长肿瘤患者的无进展生存和5 年总生存率, 在肿瘤内科治疗史上具有划时代的意义。而单抗类药物中的“明星产品”——阿达木单抗(Adalimumab/Humira)则是一种抗TNF-α 全人源化单克隆抗体, 自2003 年美国FDA 批准以来已经在全球90多个国家获批治疗类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、克罗恩病等15 个适应证, 相关系列产品的年销售额近200 亿美元, 位列全球抗体类药物销量首位, 其疗效及安全性得到了广泛验证与认可。

　　近年来更是诞生了抗体-偶联药物、双特异性及多特异性抗体、抗体融合蛋白、小分子抗体等多种新型单克隆抗体, 使得单抗类药物具有更大的生命力及发展前途。

　　针对传染病的单克隆抗体也有其发展前景, 正如百多年前Berhing 和Kitasato 所期待的那样。新临床研究显示,两种治疗埃博拉出血热的单抗类药物MAb114 和REGNEB3可有效降低感染者的死亡率, 其疗效均优于既往被寄予厚望的其他药物。

　　MAb114 是一种从1995 年刚果埃博拉幸存者的血液中提取筛选的单克隆抗体。 REGN-EB3 则是再生元公司开发的3 个全人源化抗埃博拉病毒单克隆抗体组合而成的“鸡尾酒”。

　　这两种单抗类药物为战胜埃博拉病毒带来了新的希望和曙光。同时, MAb114 的成功也再次将康复病人血清抗体的治疗作用推向了研究的“风口浪尖”,更让人们想起了2003 年SARS(severe acute respiratory syndrome)时期, 将病愈个体的血清注入SARS 患者体内从而治愈病患的情况。

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