mRNA篇｜mRNA猴痘疫苗100%保护小鼠免受感染：中国生物最新研究

　　#猴痘疫苗#

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　　前言

　　2022年1月起，全球多个区域报告了猴痘病例，随后急速扩散。2022年7月，由于猴痘病例数不断攀升、涉疫国家和地区不断增加，世界卫生组织（WHO）将猴痘定义为国际公共卫生紧急事件（PHEIC）。据2022年12月6日WHO最新统计数据显示，全球已报告82,088例猴痘感染病例，涉及110个国家，其中64例死亡。

　　对猴痘的症状、传播和治疗感兴趣的小伙伴可查看既往文章：【对症创药】猴痘将至，不注意可是要毁容的哟——猴痘你必须要了解的二三事

　　中国大陆于9月16日报道了首例境外输入的猴痘病例，与此同时，国内关于猴痘疫苗的研究也逐渐起步，并取得快速进展。既10月份从感染患者临床样本中分离出猴痘病毒毒株，国药集团中国生物武汉生物制品研究所启动了疫苗研究工作。

　　2022年11月19日，中国生物董事长杨晓明团队公布了mRNA猴痘疫苗的最新研究成果，文章以预印本形式发表在bioRxiv，题为《Novel mRNA vaccines encoding Monkeypox virus M1R and A35R protect mice from a lethal virus challenge》。

　　原文摘要：

　　根据既往痘病毒疫苗相关的基础研究数据，该团队设计了三种LNP-mRNA候选疫苗，编码猴痘病毒抗原M1R和A35R，其中VGPox 1和VGPox 2编码A35R-M1R融合蛋白，二者A35R蛋白长度不一致；第三款候选疫苗VGPox 3由编码A35R和M1R全长蛋白mRNA等量混合制成。

　　结果显示，三款疫苗均可产生A35R抗体，仅VGPox 1和VGPox 2可产生M1R抗体；使用致死剂量的牛痘病毒（与猴痘病毒具有高度同源性）进行鼻内挑战，三款疫苗均完全保护小鼠免受感染，肺部病毒完全清除，且相比VGPox 3中A35R和M1R的单独表达模式，VGPox 1和VGPox 2中A35R-M1R融合蛋白的表达模式对抗病毒的免疫效果更佳，有望开发为新型猴痘病毒疫苗。

　　研究背景

　　猴痘病毒(MPXV)与天花病毒(smallpox)、牛痘病毒(VACV)同属于痘病毒科正痘病毒属，是双链DNA病毒。目前有三种可用的痘病毒疫苗：ACAM2000（牛痘病毒活疫苗）、安卡拉改良痘苗（MVA）和JYNNEOS（非复制型牛痘活疫苗），均为活病毒疫苗，而活疫苗病毒仍存在安全隐患，尤其对于免疫缺陷人群，亟需基于新的疫苗技术开发猴痘疫苗，如重组蛋白疫苗、DNA疫苗或mRNA疫苗。

　　猴痘病毒有两种主要的感染模式，细胞外包膜病毒(EEV)和胞内成熟病毒(IMV)，从EEV和IMV中筛选合适的重组病毒亚单位疫苗可能是一种高效、安全的技术手段。据报道，使用大肠杆菌表达的重组蛋白A27L（截短的IMV表面蛋白），可保护小鼠免受牛痘病毒感染。重组蛋白EEV B5R或A33R保护小鼠免受天花病毒感染。编码L1R和A33R的DNA疫苗有效诱导中和抗体，且二者的共表达比单独表达更有效。然而，以腺病毒为载体单独表达L1R，相比L1R, A27L, A33R的联合表达更有效，且L1R和A33R是抗鼻内感染所必需的。因此，猴痘疫苗开发中病毒抗原的筛选和最优组合仍有待探索，相比传统的重组蛋白或DNA疫苗，mRNA这一新型疫苗技术也备受期待。

　　研究结果

　　病毒抗原的选择

　　作者选择了猴痘病毒A35R和M1R，其中A35R是细胞外包膜病毒(EEV)的包膜成分，与牛痘病毒A33R高度同源；M1R是胞内成熟病毒(IMV)的跨膜蛋白，与牛痘病毒L1R高度同源。基于mRNA序列设计、体外转录与纯化平台，结合脂质纳米颗粒（LNP）包封技术，作者制备了A35R或M1R的单独表达、或二者融合表达的mRNA样品。

　　mRNA的制备与体外表达验证

　　作者合成了4条经过密码子优化的mRNA序列，分别为：全长A35R、全长M1R、A35R完整胞外结合域融合全长M1R（SP-A35R IECD-M1R）、A35R较短胞外结合域融合全长M1R（SP-A35R sECD-M1R）。随后将mRNA转染293T细胞，通过SDS-PAGE 和Western Blotting验证目标蛋白的体外表达。结果显示，4条mRNA均可成功表达目标蛋白，且SP-A35R sECD-M1R组蛋白表达量高于SP-A35R IECD-M1R。

　　小结：研究设计了4条mRNA序列，其中2条编码单一抗原：全长A35R或全长M1R，2条编码A35R-M1R融合蛋白，A35R为完整或较短胞外结合域，M1R为全长蛋白。经293T细胞转染与Western Blotting验证，4条mRNA均成功表达目标蛋白。

　　

　　图1: mRNA序列设计与体外表达验证

　　LNP-mRNA疫苗成功诱导体液免疫

　　基于以上体外研究结果，作者使用LNP包封mRNA，设计了3款LNP-mRNA候选疫苗，VGPox 1与VGPox 2分别为LNP包封SP-A35R IECD-M1R和SP-A35R sECD-M1R，VGPox 3由2种LNP-mRNA（全长A35R和M1R）等量混合而成。

　　为分析LNP-mRNA疫苗能否成功诱导体液免疫，作者将3款候选疫苗VGPox 1、VGPox 2与VGPox 3通过肌肉注射接种至小鼠体内（14天时第二针加强接种），在7天, 13天和35天时采集小鼠血清，分析特异性抗体的表达水平。结果显示，接种7天后，3款候选疫苗均诱导产生了A35R抗体，且在13天和35天时抗体水平升高；7天和13天时，仅VGPox 1和VGPox 2诱导产生M1R抗体。接种13天时，对血清进行1：100稀释后，仅VGPox 1和VGPox 2组可有效中和牛痘病毒（VACV-WR）活病毒，且VGPox 2优于VGPox 1；35天时，1：50稀释血清后，3款疫苗组均可部分或完全中和活病毒，而VGPox 1和VGPox 2免疫小鼠的血清1：500稀释后，病毒中和活性显著高于VGPox 3。

　　小结：设计3款LNP包封的mRNA候选疫苗：VGPox 1和VGPox 2编码A35R-M1R融合蛋白，A35R抗原长度不同；VGPox 3由单独表达A35R和M1R的mRNA混合而成。3款疫苗诱导的A35R抗体水平相似，VGPox 1和VGPox 2诱导的M1R抗体水平显著高于VGPox 3，且VGPox 1和VGPox 2接种后短期内即可中和VACV-WR活病毒。

　　

　　图2: LNP-mRNA候选疫苗诱导的体液免疫

　　LNP-mRNA疫苗成功诱导细胞免疫

　　为验证LNP-mRNA疫苗能否激活T细胞免疫反应，研究者在接种30天时采集小鼠脾脏，并通过流式细胞仪分离细胞，随后使用猴痘病毒A35R同源蛋白A33R或重组M1R蛋白刺激脾脏细胞，根据IFNγ和CD69的水平提高，作者分别评估了CD4+和CD8+ T细胞的激活。研究结果显示，在VGPox 2和VGPox 3免疫组中，A33R可明显激活CD4+和CD8+ T细胞，而VGPox 1组没有观察到CD4+和CD8+ T细胞激活效应。另一方面，重组M1R蛋白可激活VGPox 1和VGPox 2免疫组小鼠的CD4+和CD8+ T细胞，而非VGPox 3。

　　小结：在A33R和M1R的刺激下，仅VGPox 2可激活CD4+和CD8+ T细胞免疫反应，VGPox 1对A33R的刺激无细胞应答，而VGPox 3对M1R的刺激无细胞应答。

　　

　　图3: LNP-mRNA候选疫苗诱导的细胞免疫

　　LNP-mRNA疫苗对小鼠的保护效力

　　为进一步验证LNP-mRNA疫苗能否保护小鼠免受病毒感染，在小鼠疫苗接种36天时，使用致死剂量的牛痘病毒（VACV-WR）进行鼻内挑战，分析小鼠体重变化和肺部病毒颗粒。结果显示，DPBS对照组小鼠感染2天后体重开始下降，4天后体重下降约15%，而3款疫苗免疫组小鼠体重无显著变化。此外，对照组小鼠感染9天后，肺部具有高病毒负荷，而3款候选疫苗免疫的小鼠肺部没有检测到病毒颗粒，提示肺部病毒完全清除。

　　小结：牛痘病毒鼻内挑战试验显示，3款候选疫苗均表现出100%的保护效力。

　　

　　图4: LNP-mRNA疫苗保护小鼠免受病毒感染

　　结语

　　综上所述，中国生物研发团队设计了一种新型LNP-mRNA疫苗，编码猴痘A35R胞外结构域和M1R全长的融合蛋白，可以有效诱导对抗病毒的体液免疫和细胞免疫，在致死剂量下的牛痘病毒挑战下，对小鼠具有100%的保护效力。鉴于牛痘病毒和猴痘病毒的高度同源性，提示VGPox 1或VGPox 2有望开发为潜在的mRNA猴痘疫苗。

　　mRNA疫苗具有以下优势：(1)良好的耐受性和安全性，不良反应短暂、可控；(2)无基因组整合风险，无插入突变的风险；(3)无感染风险，不需借助病毒颗粒；(4)易降解，减少体内毒性；(5)同时激活体液免疫和细胞免疫；(6)生产快速、成本低，不需细胞培养。随着mRNA疫苗的临床试验数量的迅速增加、及新冠mRNA疫苗的获批上市，mRNA技术不断发展，其翻译优化和递送系统都已取得实质性进展。

　　随着mRNA疫苗结构、稳定性和递送方法的优化，以及个性化设计与制备工艺的进展，mRNA疫苗的潜力将不断激发，有望替代或增强未来的药物开发模式。

　　为快速推进mRNA的研发进程，耀海生物推出了成熟完善的“RNASci”mRNA科研级样品制备服务平台。可提供序列设计与优化、基因合成、转录模板质粒制备、线性化模板制备、IVT和纯化及mRNA质控等一站式服务，贯穿mRNA设计至成样的全生命周期，目标编码蛋白包括但不限于eGFP、luciferase、mCherry、Cas9、SARS-CoV-2 S蛋白（含突变体）及S蛋白受体结合域RBD（含突变体）、IL-2、其他传染病（流感病毒、寨卡病毒、HIV、呼吸道合胞病毒、埃博拉病毒、狂犬病毒、猴痘病毒）等病毒抗原及抗体、肿瘤抗原及抗体，以及许多客户提供的未知蛋白，可全方位满足不同客户的不同实验或项目需求。

　　参考文献：

　　[1] Fujun Hou, Yuntao Zhang, Xiaoming Yang, et al. Novel mRNA vaccines encoding Monkeypox virus M1R and A35R protect mice from a lethal virus challenge.BioRxiv.2022Nov19.doi:https://doi.org/10.1101/2022.11.19.517190.

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