检测水中灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的具体方法

　　在一些微生物实验室或者需要无菌操作的场所，想了解灭菌的具体效果就需要生物指示物的帮助。通常灭菌指的是用物理或化学的方式将目标微生物全部杀灭，使之达到无菌保障水平，一般最常用的有化学试剂、射线、湿热、干热以及过滤等除菌手段。针对不同的微生物采用的方法也不一样。而想要验证这些方法的效果，就需要一些具有灭菌耐受力的活微生物作为指示物来进行判断。

　　今天我们要讲的枯草芽孢杆菌黑色变种主要用于各类医疗机构及制药工业领域的消毒效果验证中，其原理是经过灭菌处置后含有枯草芽孢杆菌黑色变种的水样在通过孔径为0.45um的滤膜后，细菌和芽孢被截留在滤膜上，然后将滤膜置于酪氨酸琼脂培养基上，36℃±1℃培养72h-96h，枯草芽孢杆菌黑色变种产生的酪氨酸酶可分解并利用酪氨酸形成黑色素，产生黑色的特征菌落。对特征菌落进行染色镜检后通过生化试验做进一步鉴定，能利用甘油和甘露糖，可还原硝酸盐和水解淀粉，不能利用苦杏仁苷和甘露醇，并确认为革兰氏阳性芽孢杆菌的特征菌落为枯草芽孢杆菌黑色变种，鉴定结果为阳性。

　　

　　检测所用试剂1.酪氨酸琼脂培养基。

　　2.营养琼脂培养基。

　　3.淀粉培养基和碘液。

　　4.硝酸盐还原培养基和相关试剂。

　　5.甘油复红肉汤培养基。

　　6.甘露糖生化培养基。

　　7.甘露醇生化培养基。

　　8.苦杏仁苷生化培养基。

　　9.革兰氏染色液。

　　10.芽孢染色液。

　　11.阴性对照菌：如地衣芽孢杆菌。

　　12.阳性对照菌：枯草芽孢杆菌黑色变种。

　　13.枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液

　　按照《消毒技术规范》的规定制备，也可购买浓度范围在106CFU/ml-109CFU/ml之间的市售枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液。

　　14.无菌滤膜：直径50mm，孔径0.45μm的醋酸纤维滤膜。

　　按无菌操作要求包扎，经121℃高压蒸汽灭菌20min，晾干备用；或将滤膜放入烧杯中，加入实验用水，煮沸灭菌3次，15min/次，前2次煮沸后需换水洗涤2-3次。也可采用市售的无菌滤膜。

　　15.石蜡质封口膜。

　　16.无菌水：取适量实验级纯水，经121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，备用。

　　检测所需试剂1.样品瓶：螺口带盖或磨口具塞的250ml、500ml广口玻璃瓶。

　　2.恒温培养箱：36℃±1℃。

　　3.高压蒸汽灭菌器：121℃，可调。

　　4.pH计：准确到0.1pH单位或更高精度。也可使用pH精密试纸。

　　5.显微镜：物镜4×或5×、10×、20×、40×，油镜100×，目镜10×或15×。

　　6.分析天平：实际分度值0.0001g。

　　7.培养皿：直径90mm。

　　8.过滤装置：配有砂芯滤器、圆筒形玻璃漏斗和真空泵，抽滤压力不低于-50kPa。

　　9.接种环：直径1mm-3mm。

　　10.镊子：不锈钢或一次性无菌塑料镊子。

　　11.刻度移液管：1ml、10ml。也可使用可调式移液器。

　　12.量筒：100ml。

　　13.锥形瓶：100ml。

　　14.酒精灯。

　　15.试管：10ml。

　　16.无菌操作设备：无菌室、超净工作台、生物安全柜。

　　17.一般实验室常用仪器和设备。

　　水样采集?评价使用高温高压灭菌设备的灭菌效果时，取样品瓶，加入枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液及200ml无菌水使混合液中枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢终浓度达到5×104CFU/ml-5×105CFU/ml。灭菌处置完毕后，取出样品瓶，对水样进行灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的检测。

　　评价使用其它灭菌设备的灭菌效果时，灭菌前取适量枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液加入灭菌设备，使水样中枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢终浓度达到5×104CFU/ml-5×105CFU/ml。灭菌处置完毕后，从灭菌设备中采集水样，进行灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的检测。采样量一般为样品瓶容量的80%左右，不得用样品洗涤样品瓶。样品采集完毕后，迅速用无菌包装纸包扎样品瓶。

　　样品采集后宜在2h内检测，否则应在10℃以下冷藏保存运输，但不得超过6h。实验室接收样品后，不能立即开展检测的，样品应在4℃以下冷藏保存，并在2h内检测。

　　水样过滤?用无菌镊子以无菌操作夹取无菌滤膜贴放在已灭菌的过滤装置上，固定好过滤装置。将样品充分混匀后取100 ml 抽滤，以无菌水冲洗滤器内壁2-3 次。样品过滤完成后，再抽气约5s，关上开关。过滤前按照无菌操作要求调节样品的pH值至7.0-8.0。