一种新型外泌体及其制备方法和应用与流程

　　1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种新型外泌体tnfα-exo及 其制备方法和应用。背景技术：2.炎症性肠病(ibd)是一种慢性炎症性肠病，其特征是慢性疾病持续时间 延长，包括溃疡性结肠炎(uc)和克罗恩病(cd)。ibd的确切机制尚不清楚， 但已被证明与环境、遗传和肠道菌群有关。该疾病的病理和机制的不确定， 导致对ibd治疗的研究有限。传统的治疗方法，包括免疫抑制剂和生物药 物，该类方法容易产生治疗性耐药性，疗效较差，副作用明显。抗肿瘤坏 死因子-α(tnf-α)抗体是最先进的治疗方法，但该方法对高达40％的患者 无反应。因此，迫切需要一种更合适的替代疗法。3.外泌体是30到150纳米的囊泡，富含蛋白质和复杂的核糖核酸。外泌 体具有体积小、直接作用、易于存储的优点，而且它们不面临与细胞治疗 相关的安全问题。在ibd的研究中，来自骨髓、脂肪和脐带的间充质干细 胞外泌体已被证明对ibd有治疗作用，但其治疗机制有很大不同。月经性 血源性干细胞(menscs)是一种来自女性月经性血的新型间充质干细胞。 menscs的优点包括易于获取，细胞增殖率高，没有伦理问题。然而，目前 并没有menscs治疗ibd的相关研究。4.有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：5.本发明的目的之一在于提供一种tnfα-exo。6.本发明的目的之二在于提供上述tnfα-exo的制备方法。7.本发明的目的之三在于提供上述tnfα-exo的应用。8.本发明的目的之四在于提供一种预防和/或治疗ibd药物。9.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：10.一种外泌体tnfα-exo，所述外泌体tnfα-exo通过利用含有tnf α的培养基培养menscs得到。11.进一步地，tnfα的含量为10-30ng/ml；12.优选地，所述menscs为p5-p8。13.进一步地，所述培养包括：将贴壁的menscs利用含有tnfα的培养 基培养至80％-90％融合度。14.进一步地，所述外泌体tnfα-exo的mir-24-3p含量升高；15.优选地，含有tnfα的培养基培养menscs后，还包括无血清培养基 培养36-60h的步骤，收集上清液分离得到外泌体tnfα-exo。16.上述外泌体tnfα-exo的制备方法，利用含有tnfα的培养基培养 menscs后无血清培养基培养36-60h，经收集上清分离得到所述外泌体tnf α-exo。17.进一步地，tnfα的含量为10-30ng/ml。18.进一步地，所述培养包括：将贴壁的menscs利用含有tnfα的培养 基培养至80％-90％融合度。19.上述外泌体tnfα-exo在如下任一项中的应用：20.(a)制备预防和/或治疗ibd药物；21.(b)促进m1巨噬细胞转化为m2巨噬细胞；22.(c)抑制irf-1基因表达。23.一种预防和/或治疗ibd药物，包括上述外泌体tnfα-exo。24.进一步地，给药方式包括腹腔注射、静脉注射或皮下注射。25.与现有技术相比，本发明的技术效果为：26.发明人经研究发现，menscs经tnfα刺激后产生的外泌体tnfα-exo 可以促进m2巨噬细胞的极化，降低促炎因子的表达，对ibd有显著的疗 效。同时，外泌体tnfα-exo可在巨噬细胞静息状态下维持稳定未代谢， 起到积极的预防作用。附图说明27.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下 面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普 通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获 得其他的附图。28.图1为实施例2提供的流式细胞术检测menscs的cd29、cd34、cd45、 cd73、cd90、cd105、cd117、hla-dr表面标记物检测结果，绿线是每 个标记的同型控制，紫色线表示表面标记；29.图2为实施例2提供的menscs的三系分化和形态的光学图像，其中， a为menscs显微镜图片，b为成脂分化，c为成骨分化，d为成软骨分化；30.图3为实施例2提供的外泌体的透射电镜图；31.图4为实施例2提供的外泌体的纳米颗粒跟踪分析(nta)结果；32.图5为实施例2提供的采用westernblot法评价exo和tnfα-exo的表 面标记物(cd63、tsg101、cd81和gapdh)，以menscs为对照，以gapdh 为阴性对照；33.图6为实施例2提供的小鼠急性ibd腹腔注射exo和tnfα??exo(200μg/小鼠)(n＝6)后的dai得分情况；34.图7为实施例2提供的小鼠急性ibd腹腔注射exo和tnfα??exo(200μg/小鼠)(n＝6)后的体重变化情况；35.图8为实施例2提供的小鼠急性ibd腹腔注射exo和tnfα??exo(200μg/小鼠)(n＝6)后的mpo活性检测结果；36.图9为实施例2提供的第8天，牺牲小鼠，获得结肠长度数据和大体 结肠图像；37.图10为实施例2提供的在4％多聚甲醛中浸泡48小时后，结肠脱水， 用苏木精和伊红(he)染色后的照片，原始放大倍数，×40(上)，×100(下)， *p《0.05和**p《0.01，***p《0.001通过单因素方差分析；38.图11为实施例2提供的双盲情况下的h&e染色结果病理评分结果；39.图12为实施例2提供的用elisa(n＝6)检测小鼠结肠内细胞因子水平结 果；40.图13为实施例2提供的口服fitc-右旋糖酐(0.6mg/g体重)4小时后， 血清中fitc-右旋糖酐水平(n＝6)；41.图14为实施例2提供的免疫组化染色(ihc)后，获得紧密连接蛋白 zo1、zo2和闭锁蛋白的光学图像，原始的放大倍数，×400，*p《0.05和 **p《0.01，***p《0.001通过单因素方差分析；42.图15为实施例2提供的每天记录慢性ibd小鼠的临床症状，根据体重 减轻、粪便一致性、粪便中的血液和精神状态进行dai评分的结果；43.图16为实施例2中每只小鼠的结肠长度测量结果；44.图17为实施例2中采用elisa法检测结肠组织中tnfα、ifn-γ、 il-10、il-1β、il-6的水平结果；45.图18为实施例2中h&e染色小鼠结肠的照片和病理评分结果；46.图19为实施例2中用100ng/mllps处理，加入100ng/mil-4或 100ug/mltnfα-exo，通过流式细胞术检测m2的比值；47.图20为实施例2中采用pcr方法检测不同处理后raw264.7中tnf α、il-1β、il-17、ifn-γ、inos和arg1的mrna表达结果；48.图21为实施例2中用raw264.7检测pkh26标记的外泌体，用fitc??哌烷嘧啶和dapi染色，共聚焦显微镜观察结果；49.图22为实施例2中采用elisa法检测小鼠结肠m2巨噬细胞arg1水 平和m1巨噬细胞inos水平；50.图23为实施例2中流式细胞术显示，结肠lpmc中pkh26+细胞中含 有pkh26标记的tnfα-exo的比例；51.图24为实施例2中将pkh26标记的外泌体腹腔注射到小鼠体内，对 小鼠结肠进行dapi、f4/80和arg1的免疫荧光实验，共聚焦显微镜观察；52.图25为实施例2中mirna测序exo和tnfα-exo之间mirna表 达差异热图；53.图26为实施例2中样本间mirna差异表达散点图和mirna差异表达 火山图；54.图27为实施例2中分析差异表达mirnas的靶基因进行kegg通路富 集结果；55.图28为实施例2中mirna测序结果经pcr检测证实的检测结果；56.图29为实施例2中流式细胞术检测tnfα处理后0、1、3、5天menscs 的凋亡情况；57.图30为实施例2中mir-24-3p靶向基因irf1与结合位点预测和验证 结果；58.图31为实施例2中在dss诱导的急性ibd小鼠中，腹腔注射tnfα??exo后，通过免疫印迹法检测irf1蛋白的表达；59.图32为实施例2中lps+pbs经对照、lps和lps+tnfα-exo三次 处理后获得raw264.7的wb图像；60.图33为实施例2中流式细胞仪图像显示不同处理下raw264.7的 m1(f4/80+inos+)和m2(f4/80+cd206+)巨噬细胞的比例；61.图34为实施例2中用mir-24-3p模拟物转染48h后，lps刺激的 raw264.7细胞中arg1、inos和irf1的western印迹图像以及在menscs 培养过程中，转染mir-24-3p抑制剂，收集上清，分离mir-24-3p抑制剂 tnfα-exo，mir-24-3p抑制剂tnfα-exo与raw264.7共培养的 westernblot图像；62.图35为实施例2中wb验证在raw264.7中转染si-irf1和irf1oe 对irf1表达的影响。具体实施方式63.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然， 所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得 的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。64.本发明提供一种外泌体tnfα-exo，通过利用含有tnfα的培养基培 养menscs得到。65.menscs作为一种间充质干细胞，具有来源广泛、增殖快、无伦理问题 的优点。menscs的细胞状态随年龄而变化，老年供者(》40岁)提供的 menscs的长期传代能力降低。然而，细胞的免疫表型特征并不随年龄而显 著变化。本发明中所用的menscs来自于20-30岁的月经初潮女性。66.tnfα作为一种促炎细胞因子，在结肠炎的发病机制中起着重要作用。 用tnfα预处理menscs是为了强迫menscs分泌的外泌体倾向于抑制 tnfα。在实验中，发明人还发现tnfα-exo降低了体内外tnfα的表达。 tnfα，一般来说，是由m1巨噬细胞分泌的，在炎症性肠病的发病机制中 起着重要作用。m1巨噬细胞引起的过度炎症是导致ibd的一个非常重要的 原因，本发明中外泌体tnfα-exo可以促进m2巨噬细胞的极化，降低促 炎因子的表达，对ibd有显著的疗效。同时，外泌体tnfα-exo可在巨噬 细胞静息状态下维持稳定未代谢，起到积极的预防作用。67.在优选的实施方式中，外泌体tnfα-exo的mir-24-3p含量升高。 mir-24-3p通过结合下游irf1mrna的3’utr区来改变巨噬细胞的极化， 导致irf1的表达下调，然后改变m2巨噬细胞的极化，从而缓解炎症，达 到治疗ibd的目的。68.本发明提供的外泌体tnfα-exo的制备方法如下：69.先利用含有tnfα的培养基培养menscs，再用无血清培养基培养 36-60h，经收集上清分离得到所述外泌体tnfα-exo。70.在优选的实施方式中，含有tnfα的培养基中tnfα的含量可以但不限 于为10ng/ml、12ng/ml、14ng/ml、16ng/ml、18ng/ml、20ng/ml、22ng/ml、 24ng/ml、26ng/ml、28ng/ml或30ng/ml。menscs优选为p5、p6、p7或 p8细胞。71.任选地，含有tnfα的培养基进一步含有il-6。示例性地，il-6的含 量可以为在5-50ng/ml，例如为5、10、15、20、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、40、45、50ng/ml的il-6。72.在优选的实施方式中，含有tnfα的培养基培养menscs至80％-90％ 融合度。73.外泌体的优点是它们体积小，效果更直接，治疗效果更好，并且能够 自由地通过血液循环而不被困在毛细血管中。当使用menscs-exo治疗小 鼠时，除dss引起的结肠损伤症状外，没有发现其他与排斥反应相关的症 状。本发明还提供上述外泌体tnfα-exo的应用，外泌体tnfα-exo可以 用于制备预防和/或治疗ibd药物，也可以促进m1巨噬细胞转化为m2巨 噬细胞，也可以抑制irf-1基因表达。74.本发明还提供一种预防和/或治疗ibd药物，该药物包含有本发明提供 的外泌体tnfα-exo。75.在优选的实施方式中，ibd药物的给药方式可以为腹腔注射、静脉注 射或皮下注射。研究表明，给药方式并不会影响外泌体tnfα-exo的疗效， 其均能迅速被血液系统清除，被巨噬细胞吸收，达到治疗疾病的目的。同 时，在巨噬细胞静息状态下维持稳定未代谢，起到积极的预防作用。76.下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。77.本发明中所有动物护理和实验方案均经浙江大学动物护理和使用委员会批准。78.雄性c57bl/6j小鼠(6-8周龄)购自slac实验动物有限公司(中国上海)。 所有动物都被安置在24±2℃、湿度60％、12/12小时的光/暗循环室内，可 以免费获得食物和水，每个笼子有5只动物。79.实施例1实验方法80.1、menscs的分离与培养81.menscs从女性志愿者的月经血中获得。使用divacup(kitchener,on) 收集20至30岁的健康年轻女性(n＝3)的月经血液样本。新鲜的月经血液 样本在含有两性霉素b、硫酸庆大霉素、硫酸卡那霉素、头孢氨苄、盐酸 万古霉素和肝素的4℃原液中孵育过夜。4℃2000rpm离心10min，用上清 液进行微生物检测。82.用ficoll-pague(dakewe，中国)密度梯度离心法分离月经血中的单个 核细胞。收集夹层细胞，在含有15％澳大利亚胎牛血清(fbs)的α-mem培 养基(gibco，美国)中培养。在37℃细胞培养箱中培养48小时后，细胞完全 粘附，更换新鲜培养基。细胞用0.25％胰蛋白酶-edta(fisher scientific，美国) 完全消化5min，在完全培养基中中和，离心完成传代培养。menscs的5-8 代(p5-p8)通常用于与细胞共培养、收集外泌体和注射到动物体内。为了减 少细胞损伤，我们使用90％胎牛血清和10％二甲亚砜(dmso)进行细胞低温 保存。83.2、menscs的表征及流式细胞术分析84.为了验证menscs的多向分化潜能，我们通过15-30天将menscs细胞 诱导为骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。细胞分化一定程度后，分别用茜素 红、油红o和阿昔洛韦蓝染色。采用流式细胞术(acea novocyte,aceabiosciences,usa)鉴定menscs表面标记物。用0.25％胰蛋白酶-edta消 化细胞后，将细胞悬浮于染色缓冲液(bd biosciences,san jose,ca,usa) 中，并在抗体孵育前洗涤两次。最后一次离心后，用50μl染色缓冲液重悬 细胞，抗体在4℃的避光振荡台中孵育15-30min。与藻红蛋白(pe)结合的抗 体包括cd29、cd34、cd45、cd73、cd90、cd105和cd117以及 hla-dr(biosciences,san jose,usa)。85.3、外泌体分离86.通过超高速离心从menscs的细胞培养上清中分离出外泌体。将 menscs传代到p5-p8后，细胞粘附在壁上过夜，用20ng/ml tnfα或不用 tnfα培养至80％-90％融合度。之后细胞在无血清培养基中培养48h，收集 细胞上清。收集到的细胞上清液首先分几个步骤(分别为300、2000和 10000g，中低速离心10、20和30min)，以去除死细胞和细胞碎片。离心后， 通过0.22μm过滤器(millipore,usa)过滤上清液，并收集滤液。滤液在 超高速离心机(beckman counter,usa)中10万g离心70分钟，弃上清， pbs重悬，10万g再次离心70分钟。离心得到的沉淀为外泌体。加入少量 pbs再悬浮后，以-80℃保存在冰箱中。使用bca检测试剂盒(beyotime， 中国)对外泌体裂解蛋白(beyotime，中国)进行定量。menscs来源的外泌体 (exo)和tnf-α预处理的menscs来源的外泌体(tnfα-exo)都可以通过直 接加入细胞培养基或注射到动物中而在体外和体内发挥作用。采用mirna 分离试剂盒(qiagen，usa)分离外泌体mirna，采用q-pcr检测mir-24-3p 的相对表达量。87.4、外泌体的鉴定88.外泌体主要通过透射电镜、纳米颗粒示踪分析和western blotting(wb) 进行鉴定。用透射电镜(tem)鉴定外泌体时，首先固定外泌体，然后在疏水 膜上放置一个铜网。将20μl固定悬浮液加入铜网中。抽去侧面多余的液体 后，用1％醋酸铀酰染色，在室温下静置5分钟，用蒸馏水洗涤。干燥后， 在透射电镜下观察(thermo fei,czech republic)。用纳米视觉ns500(malvin, england)鉴定外泌体的粒径分布和浓度。用ripa裂解液裂解有或没有tnf α处理的menscs和外泌体后，使用bca试剂盒对蛋白量进行校正，确保 每组样本量为20μg。用gapdh、cd63、cd81和tsg101标记物进行 wb实验。89.5、外泌体的标记90.exo和tnfα-exo用红色荧光染料pkh26(sigmaaldrich，美国)染色。 将1μl pkh26加入到250μl稀释剂c中，并在混合物中加入25μl外泌体。 在室温下孵育5min后，500μl的外泌体耗尽胎牛血清(胎牛血清)停止染 色，然后再用超滤离心提取外泌体。raw264.7在24孔板上培养，当细胞 融合达到70％时，将pkh26标记的外泌体添加到细胞中。24小时后，用 4％多聚甲醛固定细胞30分钟。用pbs洗涤3次后，分别用苯丙胺和dapi 处理，然后用抗荧光猝灭密封片密封，用奥林巴斯ix-83-fv3000-osr仪器 (olympus corporation,japan)观察。91.6、细胞转染92.mir-24-3p的mirna模拟物或抑制剂由ribobio公司(中国广州)合 成。irf1小干扰rna(sirna)和irf1过表达质粒由上海生工(中国上海) 合成。此外，还使用脂质体tm3000转染试剂(thermofisher，美国)根据制造 商的说明进行转染。采用实时荧光定量pcr或wb检测转染效率。93.7、双荧光素酶报告基因检测94.irf1 mrna的野生型(wt)或3‘?utr突变型(mut)序列，以及含有 wt序列或mut序列的重组pmirglo质粒均由oligobio生物技术公司(中 国北京)合成。通过双荧光素酶报告基因检测验证mir-24-3p与irf1之间 的直接相互作用。人胚胎肾细胞(hek293t，atcc)在12孔板中于37℃的 培养箱中培养，每孔约放置1×105个细胞。当融合程度达到60％时，转染 mirna模拟物和质粒。用无血清培养基dmem(thermo fisher,usa)和 lipo3000共转染1μg/ml质粒和50nm mirna模拟物。6小时后，用含有 10％胎牛血清的完全培养基替换12孔板中的无血清dmem。转染48小时 后，细胞被荧光素酶报告试剂盒(promega，usa)裂解液裂解，根据制造商 的说明将其放置在白色板中，用多功能酶标仪(thermo，usa)进行测试。95.8、实时荧光定量pcr和免疫印迹法96.根据说明书，使用rna提取试剂盒(qiagen，usa)从raw264.7中提 取总rna。使用prime script rt kit(takara)立即将提取的rna逆转录成 cdna，使用sybr premix taqtm kit(takara)和cfx96快速实时pcr系统 仪器(biorad，美国)对cdna进行定量聚合酶链反应(qpcr)。定量分析采用??2δδct方法。mrna定量以gapdh为内参，mirna定量以u6为内参。将 6×105细胞放置于6孔板中。对各组进行相应处理后，用ripa裂解液裂解 细胞，并在裂解过程中加入蛋白酶抑制剂。刮取细胞，15000g离心15min， 取上清液，即蛋白。使用bca试剂盒测定蛋白浓度，以平衡各组间的蛋白 浓度。然后，加入4×loaded buffer，在100℃的金属浴中保存10min。然后 用8-12％sds-page(5％浓缩胶80v，8-12％分离胶120v)分离蛋白，并转移 到pvdf膜上(220ma，90min)。用tbst和5％脱脂牛奶在室温下封闭pvdf 膜1小时。用一抗4℃孵育过夜。第二天，用tbst洗涤膜三次后，膜用二 次抗稀释剂(山羊抗兔igg(hcl)-hrp偶联物(1：3000；bio-rad)和山羊 抗小鼠igg(hcl)-hrp偶联物(1：5000；bio-rad)孵育1小时。97.实验中，使用graphpadprism8.0.2(graphpad,san diego,ca)对数据进行 统计分析。平均值的差异采用单因素方差分析(lsd t-test)和student’s t-test 进行分析。数据来自至少三个独立的实验，p值《0.05被认为是显著。98.实施例2实验结果99.1、menscs和外泌体的鉴定100.menscs主要通过光学图像、表面标记和三谱系分化来鉴定。结果显示， menscs在cd29、cd73、cd90和cd105中表达呈阳性，而cd34、cd45、 cd117和hla-dr中menscs表达较低甚至不表达(图1)。101.显微镜下，menscs呈纺锤形和纤维状(图2的a)。102.menscs的多能性可以通过三谱系分化来评估，包括成脂性，成骨性和 成软骨性。在特殊的诱导培养基中培养21～30天后，通过染色可以观察到 成脂分化、成骨分化和成软骨分化(图2的b-d)。103.通过透射电镜可以看到exo和tnfα-exo的形态，直径约为120nm 的椭圆形双层脂质囊泡(图3)。104.在纳米颗粒跟踪分析中，exo和tnfα-exo的直径均为30-150nm。 (图4)。exo的平均直径为166.8nm，tnfα-exo的平均直径为163.9nm。105.在wb验证的外泌体中，cd63、cd81、tsg101在exo和tnfα-exo 中显示条带，而相应的mscs作为对照显示弱条带或无条带(图5)。106.2、tnfα-exo可减轻右旋糖酐硫酸钠(dss)诱导的小鼠急性ibd107.采用口服5％葡聚糖硫酸钠(dss)7d建立急性ibd模型，采用疾病活 动性指数(dai)每日监测临床症状。次日口服外泌体，第7天用普通饮用水 替代小鼠。慢性建模的方法为：小鼠分别喂3％dss水1周，正常水1周， 重复一循环，模型制作时间为28天。观察dai和死亡率。108.口服5％dss后第二天，小鼠出现松弛弯腰。腹腔注射外泌体可缓解随 后的临床症状，tnfα-exo比exo更有效(图6)。109.每日体重监测显示，除对照组外，各组体重均有所减轻，tnfα-exo 组体重减轻明显小于其他组(图7)。110.髓过氧化物酶(mpo)的活性可以反映中性粒细胞的浸润，而过量的 mpo活性也会损害组织本身。在外泌体治疗后，我们发现mpo活性降低 (图8)。111.结肠长度没有未治疗组那么短(图9)。特别是，tnfα-exo组的结肠 长度几乎没有变化。从结肠的直接观察中可以看出，dss组的整体结肠呈 红色，通透性增加，结肠内容物松动，严重缩短，而外泌体治疗组，包括 exo组和tnfα-exo组，显著改善。112.h&e染色显示，dss导致结肠结构不完全、隐窝丢失、结构破坏和炎 症细胞浸润。然而，在dss+tnfα-exo组，结肠组织比dss+pbs组更完 整，淋巴细胞数量并不高(图10)。113.此外，我们对双盲情况下的h&e染色结果进行了半定量分析，结果通 过病理评分表示(图11)。该病理评分可反映结肠状态，病理评分越高，结肠 损伤越严重。经外泌体治疗后，小鼠结肠的病理评分明显下降。114.3、tnfα-exo可影响炎症细胞因子的表达和肠上皮细胞的完整性115.炎症介质的功能障碍和肠道屏障功能障碍是ibd的两个显著特征。在 酶联免疫吸附试验(elisa)中，exo或tnfα-exo处理后，促炎细胞因子 tnfα、ifn-γ、il-6和il-17的表达下调，而抗炎细胞因子il-10的表达 上调(图12)。为了探讨肠上皮的完整性，采用免疫化学方法研究了结肠紧 密连接蛋白zo1、zo2和闭锁蛋白的表达，以及fitc-葡旋糖酐4小时后 血清中fitc-葡聚糖的含量。在fitc葡聚糖实验中，fitc的值越高，肠上 皮的通透性越高。高肠通透性表明损伤后肠上皮细胞不完整。用酶标仪检 测小鼠血清中fitc的荧光值，以反映fitc-右旋糖酐的含量。我们发现对 照组小鼠的血清中几乎没有fitc荧光，而tnfα-exo组的血清荧光远低 于其他组(图13)。此外，我们还通过免疫组化实验检测了小鼠结肠中紧密 连接蛋白zo1、zo2和闭锁蛋白的含量。从图中可以看出，这三种蛋白在 对照组和tnfα-exo组的表达量明显高于其他两组(图14)。116.4、tnfα-exo可减轻右旋糖酐硫酸钠(dss)诱导的小鼠慢性ibd117.为了探讨tnfα-exo在慢性和复发性炎症性肠病中的作用，口服 3％dss两个周期后，发现不同治疗后小鼠反复出现不同程度的血便、腹泻、 体重减轻和结肠缩短(图15)，接受两轮治疗(第7天和第16天，腹腔注射 外泌体200μg/小鼠)的小鼠临床表现更好。该组的结肠长度与未建模的对 照组最接近(图16)。118.在elisa中，腹腔注射tnfα-exo两次后，结肠中tnfα、ifn-γ、 il-6、il-1β水平显著下降。出乎意料的是，单剂剂量的il-10水平似乎高 于两剂剂量(图17)。119.h&e染色显示两剂量小鼠结肠上皮完整，隐窝和杯状细胞结构正常， 只有轻度炎症细胞浸润。在仅在第7天用外泌体处理的结肠中，颅窝损伤 和炎症细胞浸润明显(图18)。从一些数据来看，仅在第7天注射外泌体的 小鼠中炎症细胞因子的表达与在第7天和第16天注射的小鼠的表达相同。 然而，小鼠的结肠长度、h&e染色和dai均反映了两种剂量(第7天和第 16天)更好的疗效。120.重要的是，通过实验发现，在获取外泌体过程中除了用20ng/ml tnf α外添加5-50ng/ml的il-6显著有益于小鼠慢性ibd的治疗和改善。示例 性地，使用20ng/ml tnfα+50ng/ml的il-6所制备的外泌体在第七天时可 以达到用20ng/ml tnfα所制备的外泌体在16天时的效果，结肠长度回复 快，且颅窝损伤和炎症细胞浸润等快速而明显改善。另外，除了20ng/ml tnf α外，分别添加5和50ng/ml的il-6所制备的外泌体在治疗小鼠慢性ibd 中均显著优于单独用20ng/ml tnfα培养所获得外泌体，尤其是在结肠长度 回复方面。121.5、menscs-exo在体外将巨噬细胞转化为m2表型122.为了研究tnfα-exo是否能促进m2巨噬细胞的极化，我们将tnf α-exo(100μg/ml)加入到raw264.7培养物中。在外泌体治疗之前， raw264.7需要100ng/ml lps的刺激才能使巨噬细胞暴露于炎症微环境中。 与tnfα-exo或il-4共培养48小时后，流式细胞术显示f4/80+cd206+细胞超过30％，确定为m2巨噬细胞(图19)。123.为了进一步了解不同处理后细胞中炎症因子的分泌情况，我们通过 pcr验证了tnfα、ifn-γ、il-1β、il-17等炎症细胞因子的表达。然而， 与lps组相比，tnfα-exo和exo均能降低促炎因子的表达，这与我们 关于外泌体可以减轻炎症的假设相一致。我们怀疑通过不同的机制exo也 能减少炎症，尽管不如tnfα-exo。在raw264.7中，tnfα-exo可以 下调m1标记inos，上调m2标记cd206，表明tnfα-exo可以将m1 巨噬细胞转化为m2巨噬细胞(图20)。124.为了进一步探索外泌体如何影响巨噬细胞，我们用pkh26标记外泌体， 并通过免疫荧光实验在共聚焦显微镜下观察pkh26的红光位置。结果显示， 无论有无tnfα刺激，在巨噬细胞的细胞质中，pkh26标记的外泌体都很 丰富(图21)。因此，外泌体被巨噬细胞吸收到细胞质中，促进巨噬细胞类 型的改变。125.6、menscs-exo在体内将m1巨噬细胞转化为m2表型126.上述实验证明了tnfα-exo可以在体外将m1巨噬细胞转化为m2巨 噬细胞，本实施例进一步研究了是否可以在小鼠中观察到同样的作用。在 急性ibd小鼠模型中，取出口服dss 7天后处死的小鼠结肠，进行inos 和arg1的elisa检测。结果显示，腹腔注射tnfα-exo后，小鼠结肠中 arg1表达增加，inos表达减少(图22)。127.通过流式细胞术和免疫荧光，我们进一步研究了外泌体是否被结肠组 织中的细胞吸收，以及外泌体的功能是否促进了m2巨噬细胞的极化。小鼠 腹腔注射pkh26标记的外泌体，并在一周内获得小鼠结肠。然后分离固有 层单个核细胞(lpmc)，用流式细胞术进行分析。流式细胞术显示，口服dss 处理后，固有层pkh26+单核细胞数量是nc组的3倍以上(图23)。这表 明结肠黏膜固有层的单核细胞对外泌体有一定的摄取能力，而这种能力在 炎症环境中得到增强。在结肠组织的免疫荧光检测中，tnfα-exo注射组 中arg1和pkh26的阳性位点几乎相同，而其他组中arg1阳性细胞很少(图 24)。这表明，吸收tnfα-exo的巨噬细胞可以转化为m2巨噬细胞，从 而减轻结肠的过度炎症。128.在小鼠腹腔注射tnfα-exo后，tnfα-exo通过巨噬细胞缓解结肠 炎症。为了验证巨噬细胞在这一过程中的重要作用，我们试图在急性ibd 小鼠模型中用氯磷酸脂质体(凝血脂)消除小鼠中的巨噬细胞。一次腹腔 注射250μl凝脂后，7天后收集小鼠骨髓细胞(红细胞裂解后)，流式细胞 术检测。流式细胞术结果显示，f4/80+细胞百分比下降约80％，证明凝血 脂成功清除小鼠大部分巨噬细胞。我们发项在用凝血脂消除小鼠巨噬细胞 后急性ibd模型中，腹腔注射tnfα-exo后不能影响结肠炎表型。129.7、tnfα诱导来自menscs的外泌体中mirna的变化130.在illumina hiseqtm 2500平台(guangdong ribobio biotechnology co. ltd)上对menscs-exo(exo)和tnfα-menscs-exo(tnfα-exo)进行 测序。通过差异比(|log2(foldchange)|》1)和显著水平(p值《0.05)，筛选出 mirnas样本表达之间的差异。tnfα刺激后，menscs中hsa-mir-708-5p、 hsa-mir-1260b、hsa-mir-24-3p等外泌体显著上调，而hsa-mir-365a-5p、 hsa-mir-19a-3p、hsa-mir-490-5p显著下调(图25)。样本间mirna差异表达 散点图和mirna差异表达火山图反映了差异mirna表达：差异mirna， 其中38个上调，32个下调(图26)。然后，我们对所有差异表达的mirna 进行了生物通路分析。生物途径的分析是基于京都基因百科全书(kegg)生 物途径数据库(http://www.genome.jp/)。从复杂调控网络的角度，对基因集合 中生物通路的生物通路富集进行了分析。富集分析结果显示，mirna的差 异表达与特异性的病毒和细菌感染、内吞作用、pi3k-akt信号通路和调节 干细胞多能性的信号通路有关(图27)。这些结果表明，tnfα对menscs 的影响改变了menscs产生的外泌体的功能，来自tnfα-menscs的不同 mirnas参与了不同的生物学过程。通过对差异mirna及其下游靶蛋白的 分析，我们只关注mir-24-3p进行进一步研究。131.为了验证测序结果，我们从tnfα处理了0、1、2、3和4天的menscs 中提取外泌体，并使用pcr获得mir-24-3p的相对表达量。我们发现，tnf α处理的时间越长，所获得的外泌体中mir-24-3p的含量就越高(图28)。 而tnfα处理的时间越长，细胞状态越差，凋亡细胞数量越增加。因此， 用20ng/ml tnfα处理menscs 0、1、3和5天，通过流式细胞术确认细胞 凋亡的数量(图29)。最后用tnfα处理menscs 48h，获得高质量的上清液。 除了tnfα作用于menscs的持续时间，tnfα浓度也影响menscs细胞 活力。用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,cck8)对不同浓度的tnfα 处理的menscs进行定量测定，发现50ng/ml的tnfα处理48h后，menscs 数量显著减少。因此，20ng/ml的tnfα是menscs产生抗炎外泌体的安全 浓度。132.8、tnfα-exo中的mir-24-3p通过下调irf1将m1转化为m2133.生物信息学网站targetscan分析，mir-24-3p靶向的下游irf1与巨噬 细胞极化有很大的相关性。此外，该网站预测，mir-24-3p和irf1的3‘?utr 之间可能存在两个结合位点。采用双荧光素酶报告基因检测验证这两个结 合位点，探讨mir-24-3p是否能下调irf1的表达。在mir-24-3p过表达存 在或不存在的情况下，irf1位点1的野生型或突变型3‘?utr用于荧光素 酶报告基因的检测。转染的mir-24-3p与野生型3‘?utr的结合导致荧光 素酶活性降低，而突变体的3’?utr序列阻止了mir-24-3p的结合，因此 荧光素酶活性保持不变。这些结果表明，mir-24-3p可以直接作用于irf1 的3‘?utr位点1。相反，实验中第2位点的荧光素酶活性没有变化，推 测是该位点不能与mir-24-3p结合或结合后不稳定(图30)。134.在小鼠中，通过wb实验发现腹腔注射tnfα-exo也能下调小鼠结 肠中irf1的表达(图31)。这说明tnfα-exo中的mirna可能在体内发 挥重要的调控作用。wb也证实，与tnfα-exo共培养诱导raw264.7细 胞中m1标记物下调，m2标记物上调(图32)。135.tnfα-exo将巨噬细胞从m1转化为m2的机制可以通过体外流式细 胞术和wb实验来验证。流式细胞术对raw264.7进行不同处理后，发现 lps刺激显著增加m1巨噬细胞比例，添加tnfα-exo降低m1比例，增 加m2。tnfα-exo在raw264.7中的作用与mir-24-3pmimic相同，两者 均能将m2巨噬细胞提高约30％。为了证明mir-24-3p由于与irf1的mrna 结合而发挥作用，过表达irf1，发现过表达irf1(irf1oe)可以部分抵消 mir-24-3p模拟物对巨噬细胞极化的影响(图33)。在wb中也是如此，当将 tnfα-exo加入到raw264.7或转染mir-24-3p时，m2标记物上调，m1 下调。当mirna过表达(mir-24-3p mimic转染)时，下游靶蛋白也减少，当 mirna被抑制(mir-24-3p抑制剂转染)时，下游靶蛋白同时增加。敲除 (si-irf1)或过表达下游靶蛋白irf1可以部分挽救mir-24-3p模拟物或抑制 剂的作用。用nc抑制剂或mir-24-3p抑制剂转染tnfα-menscs后，获 得的外泌体与raw264.7共培养。研究发现，mir-24-3p被抑制后，tnfα??exo将不再能促进巨噬细胞的极化。这证明了mir-24-3p确实通过干扰下 游irf1的表达来影响m2的产生(图34)。通过western blot验证了si-irf1 和irf1oe对irf1表达的影响(图35)。136.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非 对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的 普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进 行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或 者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。