过表达 miR-130a-3p 对心肌细胞肥大的缓解作用研究

　　在受到神经体液因子刺激、压力超负荷损伤及其他肥厚性刺激后，心脏将会发生形态、大小、结构和功能的一系列改变，被称为心肌重构（myocardial remodeling）[]。其主要病理改变包括心肌细胞肥大、心肌纤维化等。此时，心肌细胞中的一些胚胎时期基因，如心房利钠肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、脑利钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）和肌球蛋白重链 β（β-myosin heavy chain，β-MHC）等会出现再表达[-]，且心肌细胞体积增大，蛋白质合成增多。

　　研究证实，参与心肌细胞肥大的信号通路包括细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶 B（phosphatidylinositide 3-kinases/protein kinase B，PI3K/Akt）、内质网应激、线粒体动力学改变以及活性氧刺激等[]。压力超负荷等肥厚性刺激常导致氧化应激增加并诱发内质网应激，而 PI3K/Akt 通路则可直接调控心肌细胞肥大进程[-]。但目前，心肌细胞肥大的调控机制仍未完全阐明。

　　微小 RNA（microRNA，miRNA）是一类长 19～25 个碱基的非编码 RNA 分子，其主要作用是通过与靶 mRNA 的 3'端 UTR 区结合后参与 mRNA 沉默以及基因表达的转录后调节。研究显示，miRNA 参与了多种心血管疾病的发生发展过程[]。其中，miR-130a-3p 可逆转由 PDE4D 诱导的心肌梗死过程[]。冠心病患者血浆中 miR-130a-3p 的水平与冠状动脉粥样硬化程度呈负相关[]。然而，miR-130a-3p 在心肌肥厚中的作用如何，目前尚未见报道。因此，本文旨在探索 miR-130a-3p 对心肌细胞肥大的作用及其可能的机制。

　　杜氏培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）高糖培养基、Ⅱ型胶原酶购自美国 Gibco 公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自以色列 BI 公司，荧光定量聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）引物购自中国擎科梓熙生物技术有限公司，Lipofectamine 3000 购自美国 Invitrogen 公司，RNA 提取试剂盒购自中国北京天漠科技开发有限公司，逆转录试剂盒（Rever Tra Ace 组合型）购自日本 Toyobo 公司，miRNA 逆转录及定量试剂盒、miRNA 引物及内参、miR-130a-3p mimics/inhibitor、N.C. mimics/inhibitor 购自中国广州复能基因有限公司，RT-qPCR 试剂盒 SYBR Green PCR Master Mix、增强化学发光试剂购自美国 Bio-Rad 公司，兔抗 α-actinin 购自中国杭州华安生物技术有限公司，兔抗 p-Akt、Akt 购自美国 Proteintech 公司，兔抗 p-mTOR、mTOR 购自美国 Abcam 公司，小鼠抗 GAPDH 抗体购自美国 Santa-Cruz 公司，山羊抗小鼠、兔 IgG 购自中国北京中杉金桥生物技术有限公司，PVDF 膜购自瑞士 Roche 公司，去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）购自加拿大 Sigma 公司。

　　本实验所用动物为健康 0～3 d 龄的 Sprague Dawley（SD）乳鼠（SCXK（川）2015-303），购自四川省达硕实验动物中心，C57BL/6 小鼠（SCXK（京）2016-0006）购自北京维通利华实验动物技术有限公司。本实验经四川大学华西医院动物伦理委员会批准通过（伦理备案号：2018162A）。

　　实验分组：将 7～9 周龄、22～24 g 雄性 C57BL/6 小鼠随机分为：① 假手术组（Sham 组，n = 10）；② 胸主动脉缩窄手术组（TAC 组，n = 10）。按参考文献方法[]，异氟烷诱导麻醉后气管插管，TAC 组于第 2-3 肋间分离暴露主动脉弓，结扎第二分支处；Sham 组同期开胸但不进行主动脉弓结扎。手术 4 周后 RT-qPCR 检测心肌肥大标志物 ANP、BNP 及 β-MHC 的表达，行组织学苏木精?伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察心肌细胞肥大程度。

　　按照本实验室以前报道[]的方法分离新生大鼠原代心肌细胞（neonatal rat cardiomyocytes，NRCMs）：将 0～3 d 龄的 SD 乳鼠消毒处死后，取左心室剪碎，0.05% 胰蛋白酶+0.05% Ⅱ型胶原酶 37℃ 消化三次，每次约 5 min，含加 10% FBS 的培养基终止消化。200 目筛网过滤后，300 g/min 离心 5 min，弃上清，加入含 10% FBS 的 DMEM 高糖培养基重悬细胞，置于 37℃、5% CO2 孵箱中培养。差速贴壁 1 h 后将上清移入 12/24 孔板中，24 h 换液后加入 50 μmol/L 溴脱氧尿苷（bromodeoxyuridine，BrdU）继续培养。用 α-actinin 抗体鉴定 NRCMs 的纯度。48 h 后，采用 1 × 10?5 mol/L 的 NE 处理 NRCMs 24 h 诱导其发生肥大表型。实验分组：① 对照组（n = 6）；② NE 组（1 × 10?5 mol/L，n = 6）。

　　H9c2 胚胎期大鼠心肌细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，由本实验室保存。使用含 10% FBS、1% 青霉素-链霉素和 4 mmol/L L-谷氨酰胺的 DMEM 高糖培养基，常规传代培养。采用 1 × 10?5 mol/L 的 NE 处理 NRCMs 24 h 诱导其发生肥大表型。实验分组（n = 6）：① 未加刺激的对照组；② NE 组（1 × 10?5 mol/L）。

　　转染方法：转染前一天，将 H9c2 细胞接种至含有 1 mL 完全培养基的 12 孔板中，保证转染时密度达 50%。按照说明书使用 Lipofectamine 3000 转染 miR-130a-3p mimics/inhibitor、N.C. mimics/inhibitor 24 h 后，再根据需要加入或不加 1 × 10?5 mol/L NE 刺激 24 h 诱导其发生肥大。根据使用说明书采用 miRNA mimic 工作浓度为 50 nmol/L，miRNA inhibitor 工作浓度为 100 nmol/L（根据说明书，miRNA inhibitor 往往需要较大的用量才能观察到较好的抑制效果，可能与其竞争性抑制的作用机制及作用效率有关）。

　　实验分组（n = 4）：① mimics N.C.；② mimics N.C.+NE；③ miR-130a-3p mimics；④ miR-130a-3p mimics+NE；⑤ inhibitor N.C.；⑥ inhibitor N.C.+NE；⑦ miR-130a-3p inhibitor；⑧ mimics miR-130a-3p+NE。

　　mRNA 定量检测：使用 RNA 提取试剂盒提取细胞总 RNA，将 1.5 μg 总 RNA 逆转录后采用 SYBR Green PCR Master Mix 在 qPCR 仪（CFX96TM，Bio-Rad）上对 ANP、BNP、β-MHC 等 mRNA 变化进行荧光定量检测。引物序列见 所示，β-actin 作为内参对目的基因的表达进行校正。

　　miRNA 定量检测：使用 RNA 提取试剂盒提取细胞总 RNA，将 1.5 μg 总 RNA 采用多聚腺苷酸加尾法逆转录，使用成熟体 miRNA 定量检测体系对 miR-130a-3p 进行荧光定量检测。U6 作为内参对目的 miRNA 表达进行校正。

　　RIPA 裂解组织或细胞获取总蛋白，用 BCA 法测定蛋白浓度后，取 25 μg 总蛋白上样，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，将蛋白转至 PVDF 膜，封闭后 4℃ 孵育一抗（1∶1 000）过夜，TBST 洗涤后用相应二抗（1∶3 000）室温孵育 2 h，电化学发光试剂（electrochemiluminescence，ECL）显影。GAPDH 作为内参，采用 Image J 软件对条带进行灰度分析。

　　按照本实验室以前报道[]的方法，接种细胞爬片于 24 孔板中，转染/刺激后用 4% 多聚甲醛固定，室温使用 0.5% triton + 1% BSA（PBS 缓冲液配制）封闭 1 h；一抗（1∶400，PBS 配制）于 4℃ 孵育过夜；预冷 PBS 洗涤 3 次，每次 5 min；室温使用二抗（1∶1 000，PBS 配制）避光孵育 1 h，预冷 PBS 洗涤 3 次，每次 5 min；DAPI 复染细胞核 5 min 后封片。荧光显微镜下观察并采图，Image J 软件分析细胞面积改变情况。

　　采用 SPSS 21.0 统计分析软件处理实验数据，Graphpad prism 6 绘制图片，实验结果以均数 ± 标准差表示，两组间比较采用独立样本 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05 为差异具有统计学意义。

　　通过 HE 染色（见），可观察到 TAC 组小鼠心肌细胞横截面积较 sham 组显著增大。RT-qPCR 显示（见），TAC 组小鼠心脏组织中肥厚标志基因 ANP、BNP、β-MHC 的 mRNA 水平较 Sham 组明显上升，差异具有统计学意义。

　　通过心肌细胞特异性蛋白 α-actinin 免疫荧光染色（见、），可见 NRCMs 受到 NE 刺激后，面积较对照组明显增大，差异具有统计学意义。RT-qPCR 结果（见）显示，NE 刺激组 ANP、BNP、β-MHC 的 mRNA 水平较对照组明显上升，差异具有统计学意义。

　　通过 F-actin 免疫荧光染色（见、），可观察到 NE 刺激后，H9c2 细胞面积较对照组明显增大，差异具有统计学意义。RT-qPCR 结果（见）显示，H9c2 细胞 NE 刺激组 ANP、BNP、β-MHC 的 mRNA 水平较对照组明显上升，差异具有统计学意义。

　　以 U6 为内参，RT-qPCR 结果显示（见），心肌组织中，TAC 组小鼠 miR-130a-3p 与 Sham 组相比显著下降；NRCMs 中 NE 刺激组 miR-130a-3p 与对照组相比显著下降；H9c2 细胞中 NE 刺激组 miR-130a-3p 与对照组相比显著下降，差异具有统计学意义。

　　为了探索 miR-130a-3p 能否调节心肌细胞肥大的程度，在培养的 H9c2 细胞内转染特异性 miR-130a-3p mimics 以过表达 miR-130a-3p，通过 RT-qPCR 检测其表达水平。观察到转染 48 h 后，miR-130a-3p mimics 组 miR-130a-3p 的表达较 mimics N.C.组显著上升（见）。

　　过表达 miR-130a-3p 24h 后，给予 H9c2 细胞 NE 刺激 24 h，观察到 miR-130a-3p mimics+NE 组 ANP、BNP 和 β-MHC 水平较 mimics N.C.+NE 组显著下降（见、、），且 miR-130a-3p mimics + NE 组细胞面积较 mimics N.C.+NE 组也显著减小（见、）。

　　以上结果提示过表达 miR-130a-3p 对 NE 诱导的 H9c2 细胞肥大过程有明显的缓解作用。

　　在培养的 H9c2 细胞内转染特异性 miR-130a-3p inhibitor，以抑制 miR-130a-3p 的表达，通过 RT-qPCR 检测其表达水平。观察到转染 48 h 后，miR-130a-3p inhibitor 组 miR-130a-3p 的表达较 inhibitor N.C.组下降约 98%（见）。

　　miR-130a-3p 表达 24 h 后，给予 H9c2 细胞 NE 刺激，观察到 miR-130a-3p inhibitor+NE 组 ANP、BNP 和 β-MHC 水平较 inhibitor N.C.+NE 组显著升高（见、、）。同时，H9c2 细胞面积在 miR-130a-3p inhibitor+NE 组较 inhibitor N.C.+NE 组也显著上升（见、）。

　　以上结果提示敲低 miR-130a-3p 表达可进一步加重 NE 诱导的 H9c2 细胞肥大程度。

　　研究报道，miR-130a-3p 对 Akt 信号通路的活化有影响[]，而 Akt 通路在心肌细胞肥大过程中起重要作用[]。因此，我们观察了 miR-130a-3p 对 Akt 通路信号分子，包括 p-mTOR、mTOR 和 p-Akt、Akt 蛋白表达的情况。

　　Western blot 结果发现，相对于 mimics N.C.组，在 mimics N.C.+NE 组中，H9c2 细胞中 Akt 蛋白表达显著升高，而 miR-130a-3p mimics+NE 组较 mimics N.C.+NE 组的蛋白表达水平有明显下调（见）。提示过表达 miR-130a-3p 可影响 Akt 信号通路中关键蛋白 Akt 的表达。

　　近年来研究发现，miRNA 在心肌肥厚的发生发展中起重要作用[]。文献报道，miR-1 可通过靶向 Calcineurin[]和 MCU[]影响 Calcium 通路，以及靶向 CDK6-Rb[]和 IGF-1[]影响转录而缓解心肌肥厚；而 miR-217 则可通过靶向 PTEN[]和 H3K9me2/EHMT1&2[]分别作用于 PI3K/Akt/mTOR 信号通路和转录通路加重心肌肥厚。本课题组[]的前期研究也发现，miR-297 可通过靶向 Sig-1R 并影响 ATF4/Xbps1 内质网应激通路而加重心肌肥厚。

　　近期 miR-130a-3p 的研究在代谢相关疾病中引起学者关注。肝外泌体中的 miR-130a-3p 可通过抑制 PHLPP2 和激活 AKT-AS160-GLUT4 信号通路来改善脂肪细胞的糖耐量受损[]。miR-130a-3p 在一些心血管疾病中也显示出重要的调控作用，可能参与包括心肌纤维化等心力衰竭的病理生理过程[]。本研究发现 miR-130a-3p 在压力超负荷导致的肥厚心肌组织以及肥大的心肌细胞中表达均下降。随着心肌肥厚的进展，心脏将发生重构，心肌间质的成纤维细胞发生活化[-]，过度增殖、合成及分泌增加，miRNA 在此过程中的作用也不可忽视[]。例如，miR-133a[]可通过靶向 IGF-1 而调节 Akt/GSK-3β 通路以抑制心肌纤维化；miR-29b[]在丹参酮的作用下表达升高从而可缓解心肌纤维化的发生。我们在实验中发现，miR-130a-3p 在 TGF-β1 诱导的活化原代心肌成纤维细胞中表达也下降，但由于心肌纤维化的发生机制与心肌细胞肥大的发生机制不同，故而本文仅关注 miR-130a-3p 在缓解心肌细胞肥大中的作用及机制。

　　我们的研究发现，过表达 miR-130a-3p 可缓解 NE 诱导的 H9c2 心肌细胞的肥大程度，而该作用可能是通过抑制 mTOR 及 Akt 信号分子的磷酸化水平来实现的。研究表明，mTOR 信号通路相关蛋白在压力超负荷性心肌肥厚及 H9c2 细胞肥大时表达增加[]。研究表明 PI3K/Akt 信号通路参与了心肌细胞肥大的病理过程[]，如 NE 对心脏中 α-肾上腺素能受体的作用导致 PI3K 被激活，从而使 Akt 募集和激活。一些 microRNA 对该通路中的信号分子有直接的靶向作用或间接的调控作用。最近研究显示，PIK3CA 是 miR-203 的直接靶基因[]，而过表达 miR-203 可通过抑制 PI3K/Akt 的活化从而在糖尿病心肌病所致的心肌纤维化过程中起保护性作用。另外，miR-200a-3p 可间接激活 PI3k/Akt 通路而参与心肌肥厚过程[]。因此，本研究为将来心肌肥厚的治疗提供了新的思路。

　　我们目前的研究虽然观察到过表达 miR-130a-3p 通过影响 Akt 等信号分子的活化，对心肌细胞肥大有缓解作用，但其具体作用的靶点尚不清楚，值得进一步探索。

　　利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。