一种表达IL-12的多能干细胞衍生物及应用的制作方法

　　一种表达il-12的多能干细胞衍生物及应用技术领域1.本发明属于基因工程技术领域。具体涉及一种表达il-12的多能干细胞衍生物及应用。背景技术：2.白细胞介素-12(il-12)由p40和p35两个亚基通过二硫键共价连接而成异二聚体糖蛋白， 分子量约为710-75kda。主要由激活的单核细胞和其他类型的细胞(树突状稀细胞、b细胞、 中性粒细胞以及角质细胞)产生。il-12所具备的增加nk细胞和活化t细胞的细胞活性、诱 生ifn-γ、调节th1细胞的发育等免疫学活性是il-12抗肿瘤、抗病毒效应的理论基础。有 研究发现，il-12已成为治疗肿瘤的新靶点，因此，研发一种可以在人体内源源不断地表达 il-12的多能干细胞或其衍生物，对于癌症治疗来说具有极为重要的意义。3.干细胞是一类具备自我更新能力及向特定功能体细胞分化能力的“种子”细胞，具有再 生为各种组织器官和人体的潜力，在免疫应答、衰老、肿瘤发生等重大生物学活动中发挥着 核心且不可替代的作用。依据干细胞特性的程度差异，主要将干细胞分为：全能干细胞 (totipotent stem cells)、多能干细胞(pluripotent stem cells，pscs)和成体干细胞(adult stem cell)。其中，多能干细胞pscs具备几近无限的自我更新能力，以及在正常发育条件下向胚 内所有胚层的器官、组织、细胞发育分化的潜能，典型的pscs主要包括胚胎干细胞(embryonicstem cells，escs)、胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，egcs)、胚胎癌细胞(embryoniccarcinoma cells，eccs)，以及诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，ipscs)等， 这类细胞由于其强大的功能，并且可以一定程度地通过伦理限制，因此具有十分深远和广泛 的应用前景。4.目前，在细胞治疗领域，同种异体的免疫兼容问题依然是一大难题。近年已有许多报道 通过敲除b2m、ciita等基因，实现hla-i和hla-ii细胞表面或本身基因的缺失表达，进 而使细胞具备免疫耐受或逃逸t/b细胞特异性免疫应答，产生免疫兼容的通用型pscs，为更 广泛的通用型pscs源细胞、组织、器官应用奠定了重要的基础。也有报道细胞过表达 ctla4-ig、pd-l1从而抑制同种异的免疫排斥。最近又有报道，在敲除b2m、ciita的同时， 敲入cd47，从而使细胞获得了逃逸除特异性免疫应答外，还具备免疫耐受或逃逸nk等细胞 的固有免疫应答，从而使细胞具备了更加全面更强的免疫兼容特性。然而，这些方案要么免 疫兼容不彻底，仍有通过其他途径发生同种异体的免疫排斥；要么彻底消除同种异体免疫排 斥应答，但使供体源移植物的细胞本身同时丧失了抗原提呈的能力，这给受体带来了极大的 致瘤性和病毒感染等疾病的风险。5.为此，也有研究报道了，不直接敲除b2m，而敲除hla-a、hla-b或一并敲除ciita 的同时，保留hla-c，并构建12个覆盖人群超过90％的hla-c免疫配型抗原，以此达到 移植物的细胞仍具备一定程度的抗原提呈功能，并且同时能够通过hla-c抑制nk细胞的固 有免疫应答。但这类细胞，第一，hla-i类抗原提呈的抗原类型缩小了三分之二以上，能够 提呈的抗原完整性极大地不可逆的缩小，对于各种肿瘤、病毒以及其他疾病抗原的提呈具有 极大的偏向性，仍然保留了相当程度的致瘤和病毒感染等疾病的风险，在ciita同时敲除的 情况下其致病风险更高；第二，12种高频率免疫配型的hla-c抗原种族差异很大，通过我 们核实计算部分地区仅能占到70％的比例，而中国、印度等人口大国目前尚未有权威的大样 本量的hla数据展示，这样制备出来的通用型pscs使用仍受到巨大的配型空缺考验；第三， 这种方法会经历数次反复的基因编辑工作，按每次基因编辑至少两轮单细胞分离培养计，整 个过程至少需要六轮以上的单细胞分离培养，这些流程不可避免且极大概率地因多次基因编 辑脱靶或染色质不稳定或因大量单细胞传代增殖造成细胞各种不可预测的突变，进而诱发致 癌、代谢疾病等各种问题。由此可见，这类免疫兼容方案亦为“过渡时期”的权宜之计，仍有 许多问题没有更好的解决。6.此外，还有人设计通过诱导自杀基因在供体组织、细胞致病后诱导杀死，这样做的后果 将产生严重的组织坏死、细胞因子风暴等不可预知的疾病风险问题，并且这类设计的细胞杀 死后将不复存在合适的供体细胞、组织和器官又是一大难题。技术实现要素：7.针对现有技术所存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种表达il-12的多能干细 胞或其衍生物。8.本发明的第二个目的在于提供一种表达il-12的免疫兼容的多能干细胞或其衍生物。其 中一个方案是将多能干细胞或其衍生物基因组中的b2m和/或ciita基因敲除；其中另一个 方案是在多能干细胞或其衍生物的基因组敲入免疫兼容分子的表达序列。9.本发明的第三个目的在于提供一种免疫兼容可逆的表达il-12的多能干细胞或其衍生物。 多能干细胞或其衍生物基因组中导入的免疫兼容分子的表达通过诱导型基因表达系统调控， 而诱导型基因表达系统的开启与关闭受外源诱导物的调控。当免疫兼容分子正常表达时，多 能干细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达被抑制或过表达，可以消除或降低供体 细胞和受体之间的同种异体免疫排斥应答。而当供体细胞发生病变时，可通过外源诱导物诱 导关闭免疫兼容分子的表达，恢复供体细胞的抗原提呈能力，使受体能够清除病变的供体细 胞。10.本发明所采取的技术方案是：11.一种多能干细胞或其衍生物，所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有il-12的表达 序列。12.作为优选的：13.所述il-12表达序列的敲入位点为多能干细胞或其衍生物的基因组安全位点。14.作为优选的：所述基因组安全位点包括aavs1安全位点、egsh安全位点、h11安全位 点中的一种或多种。15.作为本发明的另一个技术方案：所述多能干细胞或其衍生物的b2m和/或ciita基因被 敲除，从而得到一种表达il-12的免疫兼容的多能干细胞或其衍生物。16.作为本发明的另一个技术方案：所述基因组安全位点还敲入一种或多种免疫兼容分子表 达序列，所述免疫兼容分子用于调控多能干细胞细胞或其衍生物中与同种异体免疫排斥相关 的基因的表达，从而得到一种表达il-12的免疫兼容的多能干细胞或其衍生物。17.所述与免疫应答相关的基因包括：18.(1)主要组织相容性复合体基因，包括hla-a、hla-b、hla-c、hla-dra、hla-drb1、 hla-drb3、hla-drb4、hla-drb5、hla-dqa1、hla-dqb1、hla-dpa1和hla-dpb1 中的至少一种；19.(2)主要组织相容性复合体相关基因，包括b2m和ciita中的至少一种。20.所述免疫兼容分子包括以下的任一种或多种：21.(1)免疫耐受相关基因，包括cd47或hla-g；22.(2)hla-c类分子，包括人群中比例合计超过90％的hla-c复等位基因，或者超过 90％的hla-c复等位基因与b2m构成的融合蛋白基因；23.(3)主要组织相容性复合体基因的shrna和/或shrna-mir；24.(4)主要组织相容性复合体相关基因的shrna和/或shrna-mir。25.作为优选的：26.所述b2m的shrna和/或shrna-mir的靶序列为seq id no.6～seq id no.8中的至 少一种；27.所述ciita的shrna和/或shrna-mir的靶序列为seq id no.9～seq id no.18中的 至少一种；28.所述hla-a的shrna和/或shrna-mir的靶序列为seq id no.19～seq id no.21中 的至少一种；29.所述hla-b的shrna和/或shrna-mir的靶序列为seq id no.22～seq id no.27中 的至少一种；30.所述hla-c的shrna和/或shrna-mir的靶序列为seq id no.28～seq id no.33中 的至少一种；31.所述hla-dra的shrna和/或shrna-mir的靶序列为seq id no.34～seq id no.43 中的至少一种；32.所述hla-drb1的shrna和/或shrna-mir的靶序列为seq id no.44～seq id no.48 中的至少一种；33.所述hla-drb3的shrna和/或shrna-mir的靶序列为seq id no.49～seq id no.50 中的至少一种；34.所述hla-drb4的shrna和/或shrna-mir的靶序列为seq id no.51～seq id no.60 中的至少一种；35.所述hla-drb5的shrna和/或shrna-mir的靶序列为seq id no.61～seq id no.69 中的至少一种；36.所述hla-dqa1的shrna和/或shrna-mir的靶序列为seq id no.70～seq id no.76 中的至少一种；37.所述hla-dqb1的shrna和/或shrna-mir的靶序列为seq id no.77～seq id no.86 中的至少一种；38.所述hla-dpa1的shrna和/或shrna-mir的靶序列为seq id no.87～seq id no.96 中的至少一种；39.所述hla-dpb1的shrna和/或shrna-mir的靶序列为seq id no.97～seq id no.106 中的至少一种。40.进一步优选的：所述基因组安全位点还敲入shrna和/或mirna加工复合体基因及相关 基因和/或抗干扰素效应分子，其中：shrna和/或mirna加工复合体基因及相关基因包括 drosha、ago1、ago2、dicer1、exportin-5、trbp(tarbp2)、pact(prkra)和dgcr8 中的至少一种；所述干扰素效应分子为抗pkr、2-5as、irf-3或irf-7的shrna和/或 shrna-mir中的至少一种。41.作为优选的：所述抗pkr、2-5as、irf-3或irf-7的shrna和/或shrna-mir的靶序列 为seq id no.107～seq id no.166。42.作为优选的：所述主要组织相容性复合体基因、主要组织相容性复合体相关基因、抗pkr、 2-5as、irf-3或irf-7的shrna和/或shrna-mir的表达框架如下所示：43.(1)shrna表达框架：由5’到3’依次包括shrna靶序列、茎环序列、shrna靶序列 的反向互补序列、poly t；两个反向互补靶序列由中间一茎环序列分隔组成发夹结构，最后 连上poly t作为rna聚合酶iii的转录终止子。44.作为优选的，所述shrna表达框架中的茎环序列长度为3～9个碱基；所述poly t长 度为5～6个碱基。45.(2)shrna-mir表达框架：使用前面所述shrna-mir靶序列替换microrna-30或者 microrna-155中的靶序列得到。46.上述表达框架可根据需要在5’端加上组成型启动子或诱导型启动子，例如u6启动子、 h1启动子，以及配套的启动子调控元件。47.作为本发明的另一个技术方案：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入诱导型基 因表达系统，用于调控免疫兼容分子的表达，从而得到一种免疫兼容可逆的表达il-12的多 能干细胞或其衍生物。48.所述诱导型基因表达系统包括tet-off系统、或者二聚体诱导表达系统。49.以上所述多能干细胞包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞、或者诱导多能干细 胞；50.以上所述多能干细胞衍生物包括多能干细胞所分化的成体干细胞、各胚层细胞或组织。 所述成体干细胞包括间充质干细胞、神经干细胞。51.作为本发明的另一个优选技术方案：所述il-12表达序列包括il-12a和il-12b，序列分 别如seq id no.1和seq id no.2所示。52.以上所述的多能干细胞或其衍生物在制备il-12高表达肿瘤治疗药物中的应用。53.一种制剂，其含有以上所述的多能干细胞或其衍生物，以及药学上可接受的载体、稀释 剂或赋形剂。54.本发明的有益效果是：55.本发明表达il-12的多能干细胞或其衍生物，可用于自体细胞诱导ipscs或分化成mscs 这类低免疫源性细胞进行运用，其可在体内持续表达il-12，用于治疗il-12高表达肿瘤及相 关疾病，利于癌症治疗的开发。56.本发明表达il-12的免疫兼容多能干细胞或其衍生物，由于多能干细胞或其衍生物中的 b2m、ciita基因被敲除，或者其基因组中导入了免疫兼容分子表达序列，因而此类多能干 细胞或其衍生物的免疫源性低，将其移植到受体中时，可以克服供体细胞和受体之间的同种 异体免疫排斥问题，供体细胞能够在受体内长时间持续表达il-12。57.本发明表达il-12的免疫兼容可逆的多能干细胞或其衍生物的基因组中导入诱导型基因 表达系统以及免疫兼容分子表达序列。诱导型基因表达系统受外源诱导物的调控，通过调整 外源诱导物的添加量、持续作用时间、种类来控制诱导型基因表达系统的开启与关闭，从而 控制疫兼容分子表达序列的表达量。而免疫兼容分子可调控多能干细胞细胞或其衍生物中与 免疫应答相关的基因的表达。当免疫兼容分子正常表达时，多能干细胞或其衍生物中与免疫 应答相关的基因的表达被抑制或过表达，可以消除或降低供体细胞和受体之间的同种异体免 疫排斥应答，使得供体细胞能够长时间在受体中持续表达il-12。而当供体细胞发生病变时， 可通过外源诱导物诱导关闭免疫兼容分子的表达，从而可逆地使供体细胞表面重新表达hla i类分子，恢复供体细胞的抗原提呈能力，使受体能够清除病变的细胞，从而提高了这类通用 型多能干细胞或其衍生物的临床安全性，极大地扩展其在临床应用的价值。附图说明58.图1，aavs1 ki vector(shrna,组成型)质粒图谱。59.图2，aavs1 ki vector(shrna,诱导型)质粒图谱。60.图3，aavs1 ki vector(shrna-mir,组成型)质粒图谱。61.图4，aavs1 ki vector(shrna-mir,诱导型)质粒图谱。62.图5，sgrna clone b2m-1质粒图谱。63.图6，sgrna clone b2m-2质粒图谱。64.图7，sgrna clone ciita-1质粒图谱。65.图8，sgrna clone ciita-2质粒图谱。66.图9，cas9(d10a)质粒图谱。67.图10，sgrna clone aavs1-1质粒图谱。68.图11，sgrna clone aavs1-2质粒图谱。具体实施方式69.为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解， 这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的 实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例 中所用到的各种常用化学试剂，均为市售常规产品。70.1实验材料与方法71.1.1il-12表达序列72.il-12表达序列包括il-12a和il-12b，序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示； seq id no.1的前端加上信号肽序列seq id no.3，后端添加有taa终止子；seq id no.2 的前端加上信号肽序列seq id no.4，末端添加有tag终止子。il-12a和il-12b通过linker 序列seq id no.5连接。73.1.2干细胞或其衍生物74.多能干细胞可选自胚胎干细胞(escs)、诱导多能干细胞(ipscs)以及其他形式的因之间，故外源基因插入后影响內源基因表达的风险很小。h11位点被验证是一个基因间的 安全的转录激活区域，是aavs1、egsh位点之外的一个新的“安全港”位点。89.1.4诱导型基因表达系统90.本发明技术方案中，诱导型基因表达系统可选自：tet-off系统或者二聚体关闭表达系统：91.(1)tet-off系统92.在没有四环素存在时，tta蛋白持续作用在tet启动子上，使基因持续表达。在需要转基 因保持在一个持续表达状态下，该系统是非常有用。加入四环素时，四环素可使tta蛋白的 结构变化，使其不能与启动子结合，从而使其驱动的基因表达水平下降。为了使该系统保持“关 闭”状态，必须连续添加四环素。93.本发明将tet-off系统以及一种或多种免疫兼容分子的序列敲入多能干细胞的基因组安全 位点处，通过四环素的添加与否精准开启或关闭免疫兼容分子的表达，从而可逆调控多能干 细胞或其衍生物中主要组织相容性复合体相关基因的表达。94.(2)二聚体关闭表达系统95.二聚体介导的基因表达调控系统：化学调控靶基因转录的方法有很多种，最常见的是利 用影响转录因子活性的别构调节物进行调控。其中的一个方法是运用二聚化的诱导剂或者二 聚体在无活性的融合蛋白上重组有活性的转录因子。最常用的体系是将天然产物雷帕霉素 (rapamydn)或者无生物活性的类似物作为二聚化的药物。雷帕霉素(或类似物)同胞质蛋白 fkbp12(fkbp与fk506结合的蛋白)和一种大的丝-苏氨酸蛋白激酶，称为frap【frbp-雷 帕霉素相关蛋白，即mtor(哺乳动物的雷帕霉素靶点)】有高度亲和性，又与这两种蛋白 质相结合的功能，因此作为异源性二聚体将这两种蛋白质聚到一起。为调控靶基因转录，将 dna结合区域融合到一个或多个fkbp结构域，将转录抑制域融合到frap的93位氨基酸 部位，称为frb，这样足以结合fkbp-雷帕霉素复合物。只有在雷帕霉素存在的情况下，这 两种融合蛋白才能发生二聚化。因而抑制具有与dna结合区域相结合的位点的基因进行转 录。96.1.5免疫兼容分子的选择97.所述免疫兼容分子可以调控多能干细胞或其衍生物中同种异体免疫排斥相关基因的表达。 具体免疫兼容分子的种类及序列如表1所示：98.表1免疫兼容分子99.100.[0101][0102]以上shrna或shrna-mir免疫兼容分子的靶序列如表2所示：[0103]表2 shrna或shrna-mir的靶序列[0104][0105][0106][0107][0108][0109][0110]下面表5-表6的免疫兼容分子敲入方案中，各实验组别的shrna或shrna-mir序列均 为采用表2中的靶序列1构建得到的shrna或shrna-mir免疫兼容分子。本领域的技术人 员可以理解：以其他靶序列构建得到的shrna或shrna-mir免疫兼容分子同样可以实现本 发明的技术，均落入本发明权利要求的保护范围。[0111]1.6 shrna/mirna加工复合体基因和抗干扰素效应分子[0112]在细胞核内的初级mirna(pri-mirna)经过复合物drosha-dgcr8进行微处理，将 pri-mirna裂解成前体mirna(pre-mirna)，这时会形成发夹结构。接着，经 exportin-5-ran-gtp复合物将pre-mirna转运出核。在胞浆中与双链rna结合蛋白 trbp(tarbp2)结合的rnase dicer酶将pre-mirna分解成成熟的长度，mirna在这时还处 于双链状态。最后被转运进ago2，形成risc(rna诱导沉默复合体)。最终mirna双链 的一条链保留在risc复合物中，另外一条则排出被迅速降解掉。而dgcr8作为drosha的 主要结合蛋白，可以通过其c末端的两个双链rna结合区域与pri-mirna结合，招募并指 导drosha在pri-mirna的正确位置剪切，生产pre-mirna，pre-mirna进一步被dicer和 trbp/pact加工剪切，形成成熟的mirna。dgcr8的缺失或异常表达会影响drosha的剪 切活性，进而影响mirna的活性，导致疾病的发生。trbp能够招募dicer复合体mirna 形成risc ago2。[0113]本发明利用基因敲入技术，在基因组安全位点敲入可诱导关闭表达的针对hla i类分子 和hla ii类分子等的shrna-mir表达序列时，优选同时敲入可诱导关闭表达的shrna和/ 或mirna加工机器包括drosha(accession number:nm_001100412)、ago1(accession number: nm_012199)、ago2(accession number:nm_001164623)、dicer1(accession number: nm_001195573)、exportin-5(accession number:nm_020750)、trbp(accession number: nm_134323)、pact(accession number:nm_003690)和dgcr8(accession number: nm_022720)，以便细胞不占用其他mirna的加工，影响细胞功能。[0114]此外，在ifn诱生的过程中，双链rna所依赖的蛋白激酶(double-stranded rna-dependentprotein kinase,pkr)，它是整个细胞信号转导通路的关键因子，同时还有2’,5’寡腺苷酸合成 酶(2,5-oligoadenylate synthetase,2-5as)，这两种酶与dsrna诱生ifn密切相关。pkr能 通过磷酸化真核细胞转录因子，从而抑制蛋白质合成，使细胞停滞于g0/g1和g2/m期，并 诱导凋亡，而dsrna可以促进2-5as合成，结果导致rnase即rnasel的非特异性活化，降 解细胞内所有的mrna，致细胞死亡。i型干扰素的诱导特异性是通过irf转录因子家族成 员实现的，在细胞缺乏irf-3和irf-7的表达下，在很多病毒感染情况下i型干扰素是不能被 诱导分泌的。缺乏ifn的应答，要使其恢复，需要上述两种蛋白质的共表达才行。[0115]本发明利用基因敲入技术，在基因组安全位点处敲入免疫兼容分子shrna-mir表达序列 时，优选同时敲入可诱导关闭表达的针对抑制pkr、2-5as、irf-3和irf-7基因的shrna 和/或shrna-mir表达序列，降低dsrna诱发的干扰素反应，从而避免产生细胞毒性。[0116]shrna/mirna加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、免疫兼容分子在基因组的位 置没有限定，它们之间可以以任何次序排列，而不会相互干扰或者影响基因组其它基因的结 构和功能。[0117]具体的抗干扰素效应分子的靶序列如表3所示。[0118]表3抗干扰素效应分子的靶序列[0119][0120][0121][0122]下面表5-表6的抗干扰素效应分子敲入方案中，各实验组别的shrna或shrna-mir序 列均为采用表3中的靶序列1构建得到的shrna或shrna-mir免疫兼容分子。本领域的技 术人员可以理解：以其他靶序列构建得到的shrna或shrna-mir类免疫兼容分子同样可以 实现本发明的技术效果，均落入本发明权利要求的保护范围。[0123]1.7免疫兼容分子、抗干扰素效应分子shrna或shrna-mir的通用框架[0124](1)shrna组成型表达框架为：[0125]gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgtta gagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgt gacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaat ggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatct tgtggaaaggacgctagcgccacc(seq id no.167)n1...n21ttcaagaga(seq id no.168)n22...n42tttttt[0126]其中：[0127]a、n1...n21为对应基因的shrna靶序列，n22...n42为对应基因的shrna靶序列的反向互 补序列。[0128]b、如果质粒需要表达多个基因的shrna，则每个基因分对应一个shrna表达框架，然 后无缝连接起来。[0129]c、带不同抗性基因的组成型shrna质粒，只有抗性基因不同，其它序列一样。[0130]d、n表示a、t、g、c碱基。[0131]e、seq id no.167为u6启动子序列；[0132]f、seq id no.168为茎环序列。[0133](2)shrna诱导型表达框架为：[0134]gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttag agagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtga cgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatgga ctatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtg gaaaggactttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccac tccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatag agaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcg agtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctat cagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaag tgaaagtcgagctcggtacccgggtcgaggtaggcgtgtacggtgggaggcctatata agcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttg acctccatagaagacaccgggaccgatccagcctgctagcgccacc(seq id no.169) n1...n21ttcaagaga(seq id no.170)n22...n42tttttt[0135]其中：[0136]a、n1...n21为对应基因的shrna靶序列，n22...n42为对应基因的shrna靶序列的反向互 补序列。[0137]b、如果质粒需要表达多个基因的shrna，则每个基因分对应一个shrna表达框架，然 后无缝连接起来。[0138]c、带不同抗性基因的组成型shrna质粒，只有抗性基因不同，其它序列一样。[0139]d、n表示a、t、g、c碱基。[0140]e、seq id no.169为h1 to启动子序列；[0141]f、seq id no.170为茎环序列。[0142](3)shrna-mir组成型或诱导型表达框架为：[0143]gaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctggg attacttcttcaggttaacccaacagaaggctaaagaaggtatattgctgttgacagt gagcg(seq id no.171)m1n1...n21tagtgaagccacagatgta(seq id no.172) n22...n42m2tgcctactgcctcggacttcaaggggctactttaggagcaattatcttgttt actaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatg gtataaat(seq id no.173)[0144]其中：[0145]a、n1...n21为对应基因的shrnamir靶序列，n22...n42为对应基因的shrnamir靶序列 的反向互补序列。[0146]b、如果质粒需要表达多个基因的shrnamir，则每个基因分对应一个shrnamir表达 框架，然后无缝连接起来。[0147]c、带不同抗性基因的组成型shrnamir质粒，只有抗性基因不同，其它序列一样。[0148]d、m碱基表示a或c碱基，n表示a、t、g、c碱基。[0149]e、如果n1为g碱基，则m1为a碱基；否则m1为c碱基。[0150]f、m1碱基与m2碱基互补。[0151]1.8基因编辑系统、基因编辑方法及检验方法[0152]一、基因编辑系统[0153]本专利的基因编辑技术采用crispr-cas9基因编辑系统。使用的cas 9蛋白为cas 9(d10a)，cas 9(d10a)与sgrna结合，sgrna负责特异识别靶序列(基因组dna)，然后cas9(d10a)对该靶序列进行单链切割。基因组dna发生双链断裂(dna double strandbreak,dsb)，必须有两组cas 9(d10a)/sgrna分别对基因组dna的两条链进行切割，且切 割的距离不能太远。cas 9(d10a)/sgrna方案与cas 9/sgrna方案相比，优点是特异性更高， 脱靶的概率更低。本基因编辑系统使用的质粒或donor片段分别为：cas9(d10a)质粒、sgrnaclone质粒、donor片段。[0154](1)cas9(d10a)质粒：表达cas 9(d10a)蛋白的质粒，在sgrna的引导下特异性单链 切割基因组dna。[0155](2)sgrna质粒：表达sgrna的质粒，sgrna(small guide rna)是向导rna(guiderna，grna)，在基因编辑负责引导表达cas 9(d10a)蛋白的靶向切割。[0156](3)donor片段：两头含有重组臂，分别位于基因组dna断裂位置的左右两边，中间 含有需要插入的基因、片段或者表达元件。在donor片段存在的情况下，细胞在基因组断裂 的位置发生同源重组(homologous recombination，hr)反应。如果不添加donor片段，细胞 的基因组断裂位置发生非同源末端连接(non-homologous end joining-nhej)反应。该片段由 ki vector质粒酶切后回收获取。[0157]二、组成型质粒和诱导型质粒[0158]组成型质粒：从组成型质粒获取的donor片段，敲入基因组dna后，该片段的表达功 能不可以进行调控。[0159]诱导型质粒：从诱导型质粒获取的donor片段，敲入基因组dna后，该片段的表达功 能可以通过添加诱导物的方法来调控，相当于对表达功能添加了一个开启或者关闭的开关。[0160]三、质粒构建方法[0161](1)cas9(d10a)质粒。该质粒不再需要构建，直接从addgene(plasmid 1816,addgene) 订购。[0162](2)sgrna质粒。原始的空白质粒从addgene(plasmid 41824,addgene)订购，然后在网 站(url:https://cctop.cos.uni-heidelberg.de)输入dna序列设计靶序列，最后把不同的靶序列 分别放入空白的sgrna质粒完成构建。[0163](3)ki(knock-in)vector质粒。[0164]a.amp(r)-puc origin片段的获取。设计pcr引物，以puc18质粒为模板使用高保真酶 (南京诺唯赞生物,p505-d1)通过pcr的方法，把该片段扩增出来并回收。[0165]b.aavs1或者egsh重组臂的获取。提取人细胞的基因组dna并设计对应的引物，然 后以人的基因组dna为模板使用高保真酶(南京诺唯赞生物,p505-d1)通过pcr的方法，把这 类片段扩增出来并回收。[0166]c.各个质粒元件的获取。设计各元件的pcr扩增引物，然后以含该元件的质粒为模板使 用高保真酶(南京诺唯赞生物,p505-d1)通过pcr的方法，分别把各个质粒元件扩增出来并回 收。[0167]d.组装成完整质粒。使用多片段重组酶(南京诺唯赞生物，c113-02)把前面步骤获取的 片段连接起来，形成一个完整的质粒。[0168]四、基因编辑过程[0169]1.aavs1基因敲入的单细胞克隆操作步骤[0170](1)电转程序：[0171]供体细胞准备：人多能干细胞[0172]试剂盒：human stem cellkit 1[0173]仪器：电转仪[0174]培养基：biociso[0175]诱导质粒：cas9d10a、sgrna clone aavs1-1、sgrna clone aavs1-2、aavs1 neo vectoi、 aavs1 neo vectorⅱ[0176]注：egsh基因敲入使用的诱导质粒：cas9d10a、sgrnaclone egsh-1、sgrna clone egsh?-2、egsh-neo/egsh-puro(donor)这里的donor质粒与aavs1的比较，只有左右重组臂不 一样，其它元件都一样。由于egsh的基因编辑过程与aavs1的相同，后面就不再重复列举。[0177](2)电转后的人多能干细胞进行含g418和puro的双抗生素培养基进行筛选[0178](3)进行单细胞克隆筛选及培养，获得单细胞克隆株。[0179]2.aavs1基因敲入的单细胞克隆株培养试剂[0180](1)培养基：biociso+300μg/ml g418+0.5μg/ml puro[0181](应提前置于室温，避光条件放置30～60分钟，直至恢复到室温。注意：不应将biociso 置于37℃进行预热，避免生物分子活性降低。)[0182](2)基质胶：hesc级matrigel[0183](传代或复苏细胞前，将matrigel工作液加入细胞培养瓶皿中并摇匀，确保matrigel完 全没过培养瓶皿底部，且在使用前任意一处matrigel都不能干掉。为保证细胞能够更好的贴 壁和存活，matrigel放入37℃培养箱包被时间：1:100x matrigel不能低于0.5小时；1:200x matrigel不能低于2小时。)[0184](3)消化液：使用dpbs溶解edta至终浓度为0.5mm，ph7.4[0185](注意：edta不能使用水稀释，否则细胞会因渗透压降低而死亡。)[0186](4)冻存液：60％biociso+30％escs级fbs+10％dmso[0187](冻存液最好现配现用。)[0188]3.常规维持传代培养过程[0189](1)传代的最佳时刻以及传代比例[0190]a.传代最佳时刻：细胞整体汇合度达80％～90％。[0191]b.传代最佳比例：1:4～1:7传代，次日最佳汇合度应维持在20％～30％。[0192](2)传代过程[0193]a.事先将包被好的细胞培养瓶皿中的matrigel吸走弃掉，加入适量培养基 (biociso+300μg/ml g418+0.5μg/ml puro)，并放入37℃、5％co2培养箱中孵育；[0194]b.待细胞符合传代的要求，吸掉培养基上清，加入适量的0.5mm edta消化液到细胞 瓶皿中；[0195]c.将细胞放入37℃、5％co2培养箱中孵育5～10分钟(消化至镜下观察到大部分细胞收 缩变圆但还未漂浮即可，轻柔吹打细胞使其从壁上脱离，将细胞悬液吸到离心管内，200g离 心5分钟；[0196]d.离心后，弃上清，用培养基重悬细胞，轻柔反复吹打细胞数次至混匀，然后将细胞转 移至事先准备好包被matrigel的瓶皿中；[0197]e.细胞转移至细胞瓶皿后，前后左右水平摇匀，镜下观察无异常后，摇匀置于37℃、5％ co2培养箱中进行培养；[0198]f.次日观察细胞贴壁存活状态，吸掉培养基每天正常按时换液。[0199]4.细胞冻存[0200](1)按照常规传代的操作步骤，使用0.5mm edta消化细胞至大部分细胞收缩变圆但 尚未漂浮，轻柔吹打细胞，收集细胞悬液，200g离心5分钟，弃上清，加入适量冻存液重悬 细胞，将细胞转移至冻存管(建议六孔板汇合度80％冻存一支，冻存液体积为0.5ml/支)；[0201](2)将冻存管置于程序降温盒中，立即放入-80℃过夜(需保证冻存管每分钟温度下降 1℃)；[0202](3)次日立即将细胞转移入液氮。[0203]5.细胞复苏[0204](1)提前准备好matrigel包被的细胞瓶皿，复苏细胞前，吸掉matrigel，向细胞瓶皿中 加入适量的biociso，置于37℃、5％co2培养箱中孵育；[0205](2)将冻存管从液氮中快速取出，立即放入37℃水浴锅中快速摇晃，使细胞快速融解， 仔细观察待冰晶完全消失停止摇晃，将细胞转移至生物安全柜；[0206](3)提前加入10ml dmem/f12(1:1)基础培养基至15ml离心管，并平衡至室温，使用 巴氏吸管吸取1ml dmem/f12(1:1)缓慢加入冻存管中，轻柔混匀，将细胞悬液转移到准备好 的含有dmem/f12(1:1)的15ml离心管中，200g离心5分钟；[0207](4)小心弃掉上清，加入适量biociso，轻轻混匀细胞，种到提前准备好的细胞瓶皿中， 水平前后左右摇匀后，镜下观察无异常后，摇匀置于37℃、5％co2培养箱中培养；[0208](5)次日观察细胞贴壁存活状态，每天正常按时换液。若贴壁良好，则biociso更换 为biociso+300μg/ml g418+0.5μg/ml puro。[0209]五、aavs1基因敲入检测方法[0210]1.单细胞克隆aavs1基因敲入检测[0211](1)aavs1基因敲入检测说明[0212]a.试验目的：pcr检测经过基因敲入处理的细胞，测试该细胞是否为纯合子。由于两个 donor片段只有抗性基因的序列具有差异性，因此要判断该细胞是否为纯合子(两条染色体分 别敲入不同抗性基因的donor片段)，就需要检测该细胞的基因组是否含有两种抗性基因的 donor片段，只有双敲入的细胞才有可能是正确的纯合子；[0213]b.试验方法：首先在donor质粒内部(非重组臂部分)设计一条引物，然后在基因组 ppp1r12c(非重组臂部分)设计另一条引物。如果donor片段在基因组能够正确插入，就会有 目的条带出现，否则无目的条带出现)；[0214]c.试验方案引物序列及pcr方案如表4所示：[0215]表4试验方案引物序列及pcr方案[0216][0217]注：egsh基因敲入的检测方法跟aavs1基因敲入检测原理和方法一样，这里不再描述。[0218]2检测方法[0219]2.1.表达il-12的多能干细胞衍生物的il-12表达检测[0220]采用il-12elisa检测试剂盒来测定多能干细胞及其衍生物表达il-12的能力。收集表达 il-12的多能干细胞及其衍生物的培养上清，在酶标板上进行上样，待测样品孔先加样品稀释 液40ul后再加待测样品10ul,对照组则加不表达il-12的多能干细胞及其衍生物的培养上清， 轻轻混匀。封板后置于37℃温育30min，洗涤5次后加入酶标试剂50ul，封板后置于37℃温 育30min，再洗涤5次后加入显色液显色15min，加入终止液50ul,读数测量450nm吸光度 值。[0221]2.2cck8法检测表达的il-12对t细胞增殖的影响[0222]准备t细胞：使用ficoll密度梯度离心法(ficoll-hypaque density gradient centrifugation)分离 人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,pbmc)，再使用dynabeadstmcd3 (invitrogentm，货号：11151d)试剂盒分离出t细胞。将细胞重悬在含表达il-12的多能干 细胞培养基上清的培养基中，通过台盼蓝染色计数细胞，计数好细胞后，用培养基吹匀细胞， 铺到96孔板中，每个孔种3000个细胞，种5个复孔，然后补入培养基(含表达il-12的多 能干细胞培养基上清)至终体积150ul,每天更换相应的培养基，细胞放置在37℃5％co2培 养箱中培养48h后，使用cck8进行检测，测od450值。[0223]2.3小鼠肿瘤治疗方法[0224]在人源化nsg小鼠(the jackson laboratory(jax))中，对其右腋下皮下注射5×106肿 瘤细胞(mc结肠癌，nic肺癌，rcc肾癌)细胞，待肿瘤长到60mm3大小时，进行尾静脉注 射200ulpbs(含人免疫细胞和1×106的表达il-12的多能干细胞衍生物)进行肿瘤治疗，其中 只注射含人免疫细胞的组作为对照组。20天后处死小鼠，然后比较各组之间肿瘤大小，并进 行差异性统计分析。[0225]3.实验方案[0226]将il-12、一个或多个免疫兼容分子、shrna和/或mirna加工复合体相关基因、抗干 扰素效应分子敲入到多能干细胞基因组安全位点的实验方案如表5-表6所示，其中，“+”号表 示基因或核酸序列的敲入，“-”号表示基因敲除。[0227]表5组成型表达实验方案[0228][0229][0230]各分组的分子插入ki质粒操作的原则如下：[0231]il-12表达序列放入对应质粒的mcs2的位置，shrna放入对应质粒的shrna表达框架 内，shrna-mir放入对应质粒的shrna-mir表达框架内，其它基因放入对应质粒的mcs1 的位置。各质粒的图谱如图1-图11所示。[0232]注意：sgrna clone b2m质粒包含sgrna clone b2m-1和sgrna clone b2m-2质粒。 sgrna clone ciita质粒包含sgrna clone ciita-1和sgrna clone ciita-2质粒。[0233](1)a1分组(il-12、基因)[0234]aavs1 ki vector(shrna,组成型)质粒的mcs2放入il-12表达序列，mcs1放入其他基 因序列(若存在多个基因则使用emcv ireswt(seq id no.182，下同)连接起来)。[0235](2)a2分组(il-12、shrna、基因)[0236]aavs1 ki vector(shrna,组成型)质粒的mcs2放入il-12表达序列。shrna表达框架放 入shrna靶序列(若存在多个shrna则无缝连接起来)。mcs1放入其他基因序列(若存在多 个基因则使用emcv ireswt连接起来)。[0237](3)a3分组(il-12、shrna-mir、基因)[0238]aavs1 ki vector(shrna-mir,组成型)质粒的mcs2放入il-12表达序列。shrna-mir 表达框架放入shrna靶序列(若存在多个shrna-mir则无缝连接起来)。mcs1放入其他基因 序列(若存在多个基因则使用emcv ireswt连接起来)。[0239](4)a4分组(il-12、基因、b2m和ciita双敲除)[0240]aavs1 ki vector(shrna,组成型)质粒的mcs2放入il-12表达序列。mcs1放入其他 基因序列(若存在多个基因则使用emcv ireswt连接起来)；[0241]sgrna clone b2m质粒的靶序列放入b2m的sgrna靶序列。[0242]sgrna-b2m-1：5’-cgcgagcacagctaaggccacgg-3’(seq id no.183)；[0243]sgrna-b2m-2：5’-actctctctttctggcctggagg-3’(seq id no.184)。[0244]sgrna clone ciita质粒的靶序列放入ciita的sgrna靶序列。[0245]sgrna-ciita-1：5’-acccagcagggcgtggagccagg-3’(seq id no.185)；[0246]sgrna-ciita-2：5’-gtcagagccccaaggtaaaaagg-3’(seq id no.186)。[0247](5)a5分组(il-12、shrna、基因)[0248](同a2分组的方法)。[0249](6)a6分组(il-12、shrna-mir、基因)[0250](同a3分组的方法)。[0251]表6诱导型表达实验方案[0252][0253][0254](7)b1分组(il-12、shrna、基因)[0255]aavs1 ki vector(shrna,诱导型)质粒的mcs2放入il-12表达序列。shrna表达框架放 入shrna靶序列(若存在多个shrna则无缝连接起来)。mcs1放入其他基因序列(若存在多 个基因则使用emcv ireswt连接起来)。[0256](8)b2分组(il-12、shrna-mir、基因)[0257]aavs1 ki vector(shrna-mir,诱导型)质粒的mcs2放入il-12表达序列。shrna-mir 表达框架放入shrna靶序列(若存在多个shrna-mir则无缝连接起来)。mcs1放入其他基因 序列(若存在多个基因则使用emcv ireswt连接起来)。[0258](9)b3分组(il-12、shrna、基因)[0259](同b1分组的方法)。[0260](10)b4分组(il-12、shrna-mir、基因)[0261](同b2分组的方法)。[0262]4实验结果[0263]4.1elisa检测il-12的表达[0264]采用il-12elisa检测试剂盒来测定多能干细胞及其衍生物表达il-12的能力。收集表达 il-12的多能干细胞及其衍生物的培养上清，在酶标板上进行上样，待测样品孔先加样品稀释 液40ul后再加待测样品10ul，对照组则加不表达il-12的多能干细胞及其衍生物的培养上清， 轻轻混匀。封板后置于37℃温育30min，洗涤5次后加入酶标试剂50ul，封板后置于37℃温 育30min，再洗涤5次后加入显色液显色15min，加入终止液50ul，读数测量450nm吸光度 值。[0265]表7各实验组多能干细胞衍生物表达的il-12elisa检测[0266][0267][0268]从上表结果可以看出，本发明的多能干细胞或其衍生物所表达的il-12能在各组中表达相 对恒定，所以多能干细胞衍生物所表达的il-12不受细胞分化形态及其他外源基因(免疫兼 容改造)所影响。[0269]4.2表达il-12的多能干细胞或其衍生物的促进nk细胞增殖效果[0270]将本发明前面所述实验组方案(表5和表6)敲入ipscs、mscs、nscs、ebs细胞的基 因组安全位点aavs1，得到表达il-12细胞。使用cck8法检测其促t细胞增殖效果：[0271]表8各实验组表达的il-12对t细胞的增殖影响[0272][0273][0274]通过以上实验，可以证明本发明制备的表达il-12的干细胞或其衍生物能有效刺激t细 胞进行增殖。[0275]4.3表达il-12的多能干细胞或其衍生物的抗肿瘤效果[0276]在人源化nsg小鼠肿瘤模型中，我们对其进行注射能够表达il-12的hpscs及hpscs 源衍生物(hpscs-mscs、hpscs-nscs、hpscs-ebs)，观察其mc结肠癌，nic肺癌，rcc 肾癌的肿瘤治疗的效果。注:为避免免疫兼容问题，我们所使用的免疫细胞与hpscs及hpscs 源衍生物均来源于同一人的，且采用b2m和ciita基因敲除的免疫兼容方案。n(对照)组 是指未注射实验细胞的nsg小鼠肿瘤模型。[0277]表9表达il-12的多能干细胞或其衍生物的肿瘤治疗食中添加0.5mg/ml的dox，进行饲养小鼠，从注射表达il-12细胞开始，一直使用，直到试 验结束。[0284]表10免疫兼容分子诱导型表达组的可逆性表达测试结果[0285][0286][0287]以上实验表明：仅表达il-12的mscs(组2)，其具有低免疫源性，可以在异体内存在 一定时间，所以其能够发挥一定的肿瘤治疗效果，而进行免疫兼容改造的(组3-11，包括组 成型和可逆诱导型免疫兼容)，其免疫兼容效果更佳，比没有经免疫兼容改造的mscs在体 内存在时间更长(或能做到长期共存)，其发挥肿瘤治疗效果更佳，而组5为b2m和ciita 基因敲除组，其完全消除hla-i和hla-ii类分子产生的影响，因此其肿瘤治疗效果最佳。 但由于其组成型免疫兼容改造(基因敲入/敲除)，无法在移植物产生变异或不需要时进行清 除，从而有组8-15方案设定。组12-15中在进行注射表达il-12细胞进入小鼠的同时，对小 鼠使用dox诱导剂(一直使用)，注射表达il-12细胞的小鼠的免疫兼容效果将被消除，其 在体内存在时间与未经免疫兼容改造的mscs相当，其肿瘤治疗效果也与未经免疫兼容改造 的mscs相当。[0288]以上实施例仅为本发明的优选案例，本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明的原 理和宗旨的情况下，对这些实施例所进行的同等效果的修改和替换，均落入本发明权利要求 的保护范围。