胎源性自闭症动物模型的构建方法及其应用

　　1.本发明涉及动物模型构建技术领域，具体涉及一种胎源性自闭症动物模型的构建方法及其应用。背景技术：2.自闭症谱系障碍(autism spectrum disorder,asd)，简称自闭症，又称孤独症，是一种病因复杂的神经发育障碍性疾病。asd的临床表现具有异质性，其核心症状为社会交流障碍和刻板重复行为，这些症状在儿童早期出现并能延续一生。asd的严重程度与个体发育水平密切相关，从轻微到致残不等。基于流行病学调查，asd以男性居多，男孩被诊断为自闭症的概率是女孩的四倍以上。目前，全球asd的负担逐年增加，世界卫生组织报告的全球儿童平均患病率为62/10000(0.62％)，相当于每160个儿童中有一位asd儿童。从各国报告的情况来看，asd的实际患病率可能还要高于这个数据。美国疾病控制与预防中心的数据显示，在2014年的数据分析中，asd儿童的患病率是1:59，到2016年增加至1:54，提高了近10％。在中国首次针对asd患病率的全国性评估发现，总体人群中观察到的asd患病率为0.29％，调整响应率之后目标人群样本中估计患病率高达0.70％。asd的患病率不断攀高主要原因可能是asd病因和临床表现上异质性都非常高，导致缺乏有效的治愈方法，当前的药物治疗不能解决asd的核心行为，主要针对合并症治疗且预后较差，约有一半以上的自闭症儿童在成年后无法独立生活，需要终生照顾。因此，自闭症已成为迫切需要解决的公共卫生问题。3.近年来，“健康与疾病的发育起源(developmental origins ofhealth and disease,dohad)”学说受到广泛关注，越来越多的证据支持孕期不良宫内环境可致子代asd易感性增加。如孕期接触有机磷和汞等重金属会致子代asd发病风险增加60％；母亲孕期暴露于高水平空气污染的婴儿比低污染地区的婴儿患asd的可能性要高出两倍；孕期使用丙戊酸稳定情绪与子代asd患病风险增加有关。人群研究也显示，胎儿宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation,iugr)、低出生体重会增加asd的发生风险。提示，asd具有宫内发育起源。因此，建立稳定的胎源性自闭症动物模型对于深入探究胎源性自闭症发病机制，合理规避不良孕期环境暴露，对指导优生优育，提高人口质量具有十分重要的意义。4.目前，虽然部分动物模型因其与人类asd的相似性得到广泛应用，但没有实验模型可以完全复制asd。如asd相关基因(cntnap2、nlgn4、neurexin-1α、shank3等)的转基因小鼠模型，只针对特定基因进行突变模拟asd发生，但对如何导致一系列分子异常，神经回路改变以及最终asd行为发展改变的研究比较局限。除此之外，这些模型也只能反应遗传因素忽略了孕期环境的影响。目前还有报道孕期丙戊酸处理可诱导子代出生后asd，但仅雄性子代出现典型自闭症行为，忽略了雌性子代，从而针对女性自闭症的研究会相对滞后。因此，现有研究迫切需要建立同时诱导出雄性和雌性同样高发的胎源性asd大鼠模型，与人类asd高度相似，进一步探究其发病机制、早期预警与防治，从而造福人类。5.咖啡因是一种黄嘌呤生物碱，广泛存在于咖啡、茶、能量饮料、食物和止痛药物中，临床上可作为治疗早产儿呼吸暂停的辅助药物。咖啡因是包括孕妇在内在世界上普遍被使用的精神活性药物，大量研究已证实孕期咖啡因暴露(prenatal caffeine exposure,pce)具有胎儿发育毒性，可引起子代iugr、低出生体重，而iugr、低出生体重是asd易感的高风险因素。本技术发明人的前期研究发现，pce可构建稳定的子代iugr模型，提示pce与胎源性asd的发生密切相关。此外，人群研究表明，高脂饮食引起的肥胖与自闭症相关行为恶化之间存在直接的因果关系。在asd确诊患者中，高达90％表现出胃肠道功能障碍，这些症状的出现会加剧asd核心症状的严重程度。动物实验也证实，高脂饮食会致小鼠的肠道微生物稳态失调，增加asd易感。技术实现要素：6.本发明要解决的技术问题是提供一种成功率高、有效可靠、可重复性强、简便易行的胎源性asd动物模型的构建方法。7.为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：8.第一方面，本发明提供一种胎源性自闭症动物模型的构建方法，其特征在于：包括下列步骤：9.s1：选取健康受孕的啮齿类动物，在孕9～20天的时间段，每日给予120mg/kg咖啡因胃內灌注，孕鼠自由饮食；10.s2：孕鼠自然生产，获得f1代，以生产日作为出生后0天，出生后1天时选取窝仔数为12～14只的窝仔，调整每窝雄、雌性仔鼠各6只进行哺乳喂养；11.s3：仔鼠出生后4周断奶并雄、雌分笼，部分继续正常饮食饲养至8周；12.s4：部分子代饲养至出生后4周，再给予4周高脂饮食至8周检测行为学相关指征来综合判定自闭症发生；最终得到胎源性自闭症动物模型。13.作为优选方案，所述步骤s1中，啮齿类动物为spf级wistar、sd大鼠或昆明种小鼠。14.进一步地，所述步骤s3中，正常饮食是配方与《中华人民共和国国家标准gb14924.3-2001》规定的小鼠、大鼠配方饲料相同。15.更进一步地，所述步骤s4中，行为学检测相关指标是：社会偏好实验、埋珠实验、旷场实验、y迷宫。16.第二方面，本发明提供一种胎源性自闭症动物模型在筛选宫内环境干扰物或药物中的应用，其特征在于：所述胎源性自闭症动物模型由如以上任一构建方法得到。17.第三方面，本发明提供一种胎源性自闭症动物模型在发现胎源性自闭症早期预警及干预靶标中的应用，其特征在于：所述胎源性自闭症动物模型由如以上任一构建方法得到。18.第四方面，本发明提供一种胎源性自闭症动物模型在筛选防治自闭症治疗药物的应用，其特征在于：所述胎源性自闭症动物模型由如以上任一构建方法得到。19.作为优选方案，所述胎源性自闭症治疗药物包括吲哚丙酸。20.本发明的优点及有益效果如下：21.本发明对pce子代动物进行高脂饮食作为出生后二次打击，检测asd相关行为学指标确定asd的发生发展，进而建立胎源性asd大鼠模型。该模型模拟了胎源性asd发生发展的疾病表型，对阐明胎源性asd的发生发展机制，确定早期预警及防治具有重要意义。具体优点如下：22.1、本发明的造模方法简单，孕期给予咖啡因，子代出生后4周断奶给予4周高脂饮食可模拟出生后二次打击，采用社会偏好实验、埋珠实验、旷场实验、y迷宫等指标能够模拟自闭症患者社会互动障碍、刻板重复行为等核心症状以及认知功能障碍并发症。本模型指标稳定性好，可重复性强，为胎源性自闭症的构建提供了一种可靠的方法。23.2、基于本发明构建的胎源性自闭症模型，可用于指导孕期临床合理用药、探讨胎源性自闭症的发生发展机制、早期预警及干预靶标中的应用。附图说明24.图1为本发明行为学实验模式示意图；25.图1中：a：pce子代旷场实验；b：y迷宫；c：社会偏好实验；d：埋珠实验。26.图2为本发明孕期咖啡因暴露雄性子代大鼠吲哚丙酸(indole propionic acid，ipa)改变；27.图2中：a：肠道ipa浓度；b：血清ipa浓度；c：海马ipa浓度；d：海马ipa浓度与埋珠率相关性；e：海马ipa浓度与目标区域时间相关性；f：海马芳香烃受体(aryl hydrocarbonreceptor,ahr)蛋白和mrna表达。具体实施方式28.以下结合具体实施例和附图，对本发明的技术内容作进一步的详细阐述。29.实施例1：本发明胎源性自闭症动物模型的构建30.1、实验动物：31.spf级健康wistar大鼠，购自湖北省疾病预防控制中心，动物许可证号：scxk(鄂)2012-2014。本研究获武汉大学医学部伦理委员会批准，并严格按照国际实验动物保护认证评估机构相关处理准则执行。32.实验动物饲养于屏障环境内，温度22～25℃，湿度50％，12小时昼夜交替。33.2、实验方法：34.雄性wistar大鼠20只(体重260-300g)，雌鼠wistar大鼠40只(体重200-240g)。自由饮水进食，适应性喂养7天后，按照雄：雌＝1:2合笼，次晨阴道涂片，确定受孕大鼠，记为孕0天。35.受孕大鼠随即分为两组：对照组和咖啡因组，每组20只。自孕9～20天，咖啡因组每日胃內灌注咖啡因120mg/kg.d，对照组给予同等体积的生理盐水，给药体积均为1ml/100g。各组孕鼠均自由正常饮食。饲料购自武汉市万千佳兴生物科技有限公司，许可证号：scxk(鄂)2011-0011。饲料配方与《中华人民共和国国家标准gb14924.3-2001》规定的小鼠大鼠配方饲料相同。36.母鼠自然生产，获得f1代，以生产日作为出生后0天，出生后1天时每组选取窝仔数为12-14只的窝仔，调整每窝雄、雌性仔鼠各为6只进行哺乳喂养，以保证仔鼠均衡营养。仔鼠出生后4周(postnatal week 4,pw4)断奶并雄、雌分笼，每组随机选取20只，其中每组10只继续正常饮食饲养至pw8，每组另外10只进行为期4周高脂饮食饲养至pw8。pw8时上述所有子代鼠进行社会偏好实验、埋珠实验、旷场实验、y迷宫检测，上述实验完成后第2天，经麻醉处死动物。37.3、检测指标及方法：38.在行为学检测开始之前，将大鼠放在实验室中至少30分钟适应环境。先进行压力较小的行为测试，然后再进行压力较大的行为测试。测试顺序为：旷场实验、y迷宫、社会偏好实验、埋珠实验，行为学实验模式示意图分别如图1中a-d所示。39.3.1旷场实验40.实验装置长宽高分别为100cm×100cm×50cm的无盖木箱方盒，四周和底面全部涂黑。用酒精将方盒擦拭干净后，将大鼠置于木箱中心方格内。使用smart v 3.0智能视频跟踪系统，自动将地面划分为25个方格，记录大鼠5分钟内的探索轨迹和行为学参数。观察指标：①中央运动时间(中央9个格子的运动距离)；②中央运动距离(中央9个格子的运动距离)；③运动总距离(全部25个格子的运动距离)。41.3.2y迷宫42.进行自发交替y迷宫以评估大鼠的短期空间记忆能力。实验开始前，用酒精将迷宫的三个臂擦拭干净。两名受试大鼠之间也需用75％乙醇清洗实验仪器，并用干净的纸巾擦拭干净。自制y迷宫装置，采用聚丙烯材料，长宽高分别为50cm×10cm×20cm。首先将y迷宫三臂定义为3个不同分支(a，b，c)，大鼠由同一臂末端放置，任其自由活动8分钟，smart v3.0智能视频跟踪系统记录其活动轨迹和进入各臂的次数和次序。通常，大鼠通常更喜欢研究迷宫的一只新手臂，而不是回到以前曾经拜访过的那只。在多次手臂进入的过程中，动物应表现出进入较新访问的手臂的趋势。连续3次进入不同的臂叫一次正确交替次数，如abc，bca，cab等。最后计算自由交替率＝[正确交替次数/(进臂总次数-2)]×100％。[0043]3.3社会偏好实验[0044]实验装置是长宽高分别为100cm×50cm×50cm的四周和底面全部涂黑的长方体装置，可检测大鼠社会交流互动能力。在实验场地的两侧对称放置两个带孔的笼子，一个笼子里放物体，另一个笼子里放一只陌生小鼠作为社交线索。将受试小鼠置于两个笼子的中间，smart v 3.0智能视频跟踪系统自动记录10分钟大鼠探索物体或笼中的陌生老鼠轨迹及时间比例。[0045]3.4埋珠实验[0046]埋珠实验中的玻璃弹珠被掩埋的百分比被用作评估刻板重复行为的指标。将大鼠置于一个实验场地(80×40cm2，铺垫深度：5cm)，实验场地内有20个玻璃弹珠(彼此等距排列，排列方式为4×5)。大鼠进行15分钟的自由探索，结束后将小鼠从实验笼中轻轻取出，并记录下埋藏的弹珠数量。埋藏玻璃弹珠的标准是玻璃弹珠覆盖垫料的面积》50％。[0047]4、实验结果[0048]pce可引起雄性子代大鼠自闭症易感性增加，具体表现为：与对照组相比，咖啡因组雄性子代出现社会互动障碍，刻板重复行为，自由探索能力减弱以及空间记忆能力降低。咖啡因组雌性子代自由探索能力降低，空间记忆能力减弱，而社会互动障碍以和刻板重复行为没有出现有明显的性别差异。pce子代断奶期后给予高脂饮食至成年，雄性和雌性子代均出现自闭症样相关行为。[0049]4.1子代社会互动能力变化[0050]子代大鼠社会互动能力改变结果如表1所示。与对照组相比，pw4-pw8正常饮食咖啡因组雄性子代与有鼠靶点区域的相互作用程度较小，在探索其他区域的时间明显较多(p《0.01，表1)，而咖啡因组雌性子代没有明显差异。pw4-pw8高脂饮食后，与对照组相比，咖啡因组雄性和雌性子代都表现为与有鼠靶点区域的相互作用程度较小，在探索其他区域的时间明显较多(p《0.01或p《0.05，表1)。实验结果说明，与对照组相比，咖啡因组雄性子代其社会沟通交流能力明显减弱；给予高脂饮食后，与对照组相比，咖啡因组雄性和雌性子代社会沟通交流能力都减弱。[0051]表1：社会偏好实验正常饮食(mean±sem，n＝10)[0052][0053]高脂饮食(mean±sem，n＝10)[0054][0055]4.2子代刻板重复行为改变[0056]子代大鼠刻板重复行为改变结果如表2所示。与对照组相比，pw4-pw8正常饮食咖啡因组雄性子代弹珠掩埋数量明显增多(p《0.01，表2)，而咖啡因组雌性子代没有明显改变。pw4-pw8高脂饮食后，与对照组相比，咖啡因组雄性和雌性子代弹珠掩埋数量都明显增多(p《0.01，表2)。实验结果说明，与对照组相比，咖啡因组雄性子代刻板重复行为明显增强；给予高脂饮食后，与对照组相比，咖啡因组雄性和雌性子代均出现刻板重复行为。[0057]表2：埋珠实验正常饮食(mean±sd，n＝10)[0058][0059]高脂饮食(mean±sd，n＝10)[0060][0061]4.3子代自由探索能力变化[0062]子代大鼠自由探索能力改变结果如表3所示。与对照组相比，pw4-pw8正常饮食咖啡因组雄性和雌性子代总运动距离、中心运动距离和中心运动时间显著减少(p《0.01，表3)。pw4-pw8高脂饮食后，与对照组相比，咖啡因组雄性和雌性子代总运动距离、中心运动距离和中心运动时间显著减少(p《0.05或p《0.01，表3)。实验结果说明，与对照组相比，咖啡因组雄性和雌性子代自由探索能力都降低，出现焦虑情绪，给予高脂饮食后更为明显。[0063]表3：旷场实验正常饮食(mean±sem，n＝10)[0064][0065]高脂饮食(mean±sem，n＝10)[0066][0067][0068]4.4子代空间记忆能力变化[0069]子代大鼠空间记忆能力改变结果如表4所示。与对照组相比，pw4-pw8正常饮食咖啡因组雄性和雌性子代自由交替率均显著降低(p《0.01，表4)。pw4-pw8高脂饮食后，与对照组相比，咖啡因组雄性子代自由交替率也显著降低(p《0.05，表4)。实验结果说明，与对照组相比，咖啡因组子代出现空间记忆能力改变，给予高脂饮食后雄性症状加重。[0070]表4：y迷宫正常饮食(mean±sd，n＝10)[0071][0072]高脂饮食(mean±sd，n＝10)[0073][0074]本发明方法通过孕9-20天给予120mg/kg咖啡因处理，子代出生后4周断奶继续给予常规或高脂饮食至8周，发现pce雄性和雌性子代给予高脂饮食后均出现自闭症样的典型行为，说明成功建立了胎源性自闭症模型。本发明的造模方法简单，模型中社交能力、刻板重复行为、自由探索能力、空间记忆能力等指标稳定性好，说明本发明造模方法稳定有效可靠，可重复性强。[0075]实施例2：用本发明模型筛选胎源性自闭症的早期防治药物[0076]1、实验动物：[0077]spf级健康wistar大鼠，购自湖北省疾病预防控制中心，动物许可证号：scxk(鄂)2012-2014。本研究获武汉大学医学部伦理委员会批准，并严格按照国际实验动物保护认证评估机构相关处理准则执行。实验动物饲养于屏障环境内，温度22～25℃，湿度50％，12小时昼夜交替。[0078]2、实验方法：[0079]雄性wistar大鼠20只(体重260-300g)，雌鼠wistar大鼠40只(体重200-240g)。自由饮水进食，适应性喂养7天后，按照雄：雌＝1:2合笼，次晨阴道涂片，确定受孕大鼠，记为孕0天。[0080]受孕大鼠随即分为两组：对照组和咖啡因组，每组20只。自孕9～20天，咖啡因组每日胃內灌注咖啡因120mg/kg.d，对照组给予同等体积的生理盐水，给药体积均为1ml/100g。各组孕鼠均自由正常饮食。饲料购自武汉市万千佳兴生物科技有限公司，许可证号：scxk(鄂)2011-0011。饲料配方与《中华人民共和国国家标准gb14924.3-2001》规定的小鼠大鼠配方饲料相同。[0081]母鼠自然生产，获得f1代，以生产日作为出生后0天，出生后1天时每组选取窝仔数为12-14只的窝仔，调整每窝雄、雌性仔鼠各为6只进行哺乳喂养，以保证仔鼠均衡营养。仔鼠pw4断奶并雄、雌分笼，每组随机选取20只雄性子代，其中每组10只继续正常饲养至pw8，每组另外10只进行为期4周20mg/kg.d ipa补充治疗至pw8。pw8时上述所有子代鼠进行社会偏好实验、埋珠实验、旷场实验、y迷宫检测，上述实验完成后第2天，经麻醉处死动物，收集外周血、肠道、海马组织。检测外周血、肠道、海马组织ipa水平，海马组织ipa的受体芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,ahr)的表达。[0082]3、检测指标及方法：[0083]3.1按照实施例1方法检测子代鼠旷场实验、y迷宫、社会偏好实验、埋珠实验。[0084]3.2检测胎源性自闭症候选的代谢产物ipa变化及与典型自闭症样行为的相关性：[0085]收集pw8雄性子代肠道、外周血及海马组织，用elisa试剂盒检测肠道、血清及海马组织中ipa，进一步与典型自闭症样行为的相关性；通过western blot和rt-qpcr检测ahr的表达变化。[0086]4、实验结果[0087]pce可引起pw8雄性子代大鼠自闭症易感性增加，具体表现为：与对照组相比，咖啡因组雄性子代出现社会互动障碍，刻板重复行为，自由探索能力减弱以及空间记忆能力降低。pce子代断奶期后给予ipa治疗后自闭症样行为明显改善。[0088]4.1子代社会互动能力变化[0089]子代大鼠社会互动能力改变结果如表5所示。与对照组相比，pw8咖啡因组雄性子代与有鼠靶点区域的相互作用程度较小，在探索其他区域的时间明显较多(p《0.01，表5)。pw4-pw8ipa治疗后，与对照组相比，咖啡因组雄性子代与有鼠靶点区域的相互作用程度无差异。实验结果说明，与对照组相比，咖啡因组雄性子代其社会沟通交流能力明显减弱；给予ipa治疗后，咖啡因组雄性子代社会沟通交流能力明显改善。[0090]表5：社会偏好实验正常饲养(mean±sem，n＝10)[0091][0092]ipa治疗(mean±sem，n＝10)[0093][0094]4.2子代刻板重复行为改变[0095]子代大鼠刻板重复行为改变结果如表6所示。与对照组相比，pw8咖啡因组雄性子代弹珠掩埋数量明显增多(p《0.01，表6)。pw4-pw8 ipa治疗后，与对照组相比，咖啡因组雄性子代弹珠掩埋数量无明显变化。实验结果说明，与对照组相比，咖啡因组雄性子代刻板重复行为明显增强；给予ipa治疗后，咖啡因组雄性子代刻板重复行为减弱。[0096]表6：埋珠实验正常饲养(mean±sd，n＝10)[0097][0098]ipa治疗(mean±sd，n＝10)[0099][0100]4.3子代自由探索能力变化[0101]子代大鼠自由探索能力改变结果如表7所示。与对照组相比，pw8咖啡因组雄性子代总运动距离、中心运动距离和中心运动时间显著减少(p《0.01，表7)。pw4-pw8 ipa治疗后，与对照组相比，咖啡因组雄性子代总运动距离、中心运动距离和中心运动时间无明显差异。实验结果说明，与对照组相比，咖啡因组雄性子代自由探索能力都降低，出现焦虑情绪。给予ipa治疗后，咖啡因组雄性子代焦虑情绪缓解。[0102]表7：旷场实验正常饲养(mean±sem，n＝10)[0103][0104]ipa治疗(mean±sem，n＝10)[0105][0106]4.4子代空间记忆能力变化[0107]子代大鼠空间记忆能力改变结果如表8所示。与对照组相比，pw8咖啡因组雄性子代自由交替率均显著降低(p《0.01，表8)。pw4-pw8 ipa治疗后，与对照组相比，咖啡因组雄性子代自由交替率无差异。实验结果说明，与对照组相比，咖啡因组雄性子代出现空间记忆能力改变。给予ipa治疗后，咖啡因组雄性子代空间记忆能力改善。[0108]表8：y迷宫正常饮食(mean±sd，n＝10)[0109][0110]高脂饮食(mean±sd，n＝10)[0111][0112]4.5ipa水平变化[0113]pw8雄性子代大鼠ipa改变结果如图2所示。咖啡因组pw8雄性子代肠道、血清及海马中菌群代谢产物ipa水平降低，给予ipa治疗后，咖啡因组pw8雄性子代肠道、血清及海马中菌群代谢产物ipa水平恢复(p＜0.01，图2中a-c)；相关性分析发现，咖啡因组雄性子代海马ipa表达与其自闭症核心症状密切相关(图2中d,图2中e)；进一步检测海马中受体ahr，咖啡因组pw8雄性子代海马ahr mrna和蛋白表达下调，给予ipa治疗后，咖啡因组pw8雄性子代海马ahr mrna和蛋白表达上调(p＜0.01或p＜0.05，图2中f)。[0114]综上，本发明的造模方法通过孕期咖啡因处理，出生后部分子代4周断奶后给予ipa治疗至8周，发现pce雄性子代出现自闭症样的典型行为，给予ipa治疗后，咖啡因组雄性子代自闭症样行为改善。进一步检测菌群代谢产物ipa及其受体ahr水平，发现咖啡因组雄性子代肠道、外周血及海马ipa水平降低，补充ipa后明显恢复，并与其自闭症核心症状密切相关，ahr表达与ipa变化趋势一致。说明本方法是建立胎源性自闭症的有效方法，可用于发现治疗胎源性自闭症的早期防治药物，用于指导孕期临床合理用药、探讨胎源性自闭症作用机制靶标及筛选宫内环境干扰物及药物。[0115]显然，依据上述本发明的内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。