专家点评Science突破丨周斌研究组建立邻近细胞遗传操控技术

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　　点评丨杨晓 研究员（国家蛋白质科学中心·北京）

　　细胞之间的交流和相互作用是多细胞生物的一项基本特征，解析细胞之间的相互作用对于深入了解多种生物学过程及其调控机制具有重要意义。近30年来，科学家利用现代遗传学手段，例如遗传示踪、组织特异性基因敲除或过表达等技术，研究器官发育、组织再生及疾病发生发展等过程。但是，当前的遗传技术基本上是针对特定细胞自身进行细胞或分子水平的操作，如何深入研究细胞与细胞之间的相互作用依然面临巨大挑战。因此，亟需建立一种新的遗传操作技术，实现体内监测与记录细胞之间相互交流并解析相关细胞的功能及其分子调控机制，将极大地推动细胞生物学、遗传学及再生医学等领域的发展。

　　2022年12月2日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）周斌团队在Science上发表了题为 Monitoring of cell-cell communication and contact history in mammals 的最新研究成果。该研究利用人工合成信号通路结合遗传学技术，建立了哺乳动物体内邻近细胞遗传操控技术，基于该技术揭示了早期胚胎发育中心脏内皮细胞向肝脏迁移形成肝脏血管的现象，以及描述了肿瘤生长过程中肿瘤血管形成并从内向外迁移的过程。

　　在该项工作中，研究人员建立了一种检测细胞之间相互作用的新技术——gLCCC(genetic Labelling of Cell-Cell Contact)。基本原理是利用人工改造的Notch信号通路来操控体内两个邻近细胞，在两个细胞中分别表达人工合成的Notch配体和受体蛋白后，当细胞相互接触时，配体和受体特异性结合，引起Notch跨膜段的构象改变，接着γ-secretase酶将切断跨膜段和胞内段的连接，从而释放胞内段的人工合成遗传元件，如转录调控因子tTA、Cre等，这些遗传操作元件可以进入到细胞核内从而调控下游基因的表达，这个人工合成Notch信号通路—Synthetic Notch(SynNotch) 在体内可以实现将细胞接触转变为遗传信息。

　　首先，研究人员以心脏中心肌细胞和内皮细胞为例，将心肌细胞作为SynNotch信号发送细胞，内皮细胞作为SynNotch信号接收细胞，分别构建了心肌细胞特异性表达SynNotch配体的工具小鼠Tnnt2-mGFP，以及内皮细胞特异表达SynNotch受体的工具小鼠Cdh5-GFP抗体-Notch的跨细胞膜段-tTA，简称Cdh5-GFP-N-tTA。SynNotch受体蛋白的核心元件有三个部分：GFP纳米抗体（nanobody），它位于细胞膜外，可以与配体GFP结合；Notch的跨细胞膜段，它保留着重要的γ-secretase的酶切位点；以及位于胞内段的遗传操作元件tTA。在没有发生细胞接触时，酶切位点被隐藏在特定蛋白区域内；当细胞相互接触时，心肌细胞膜表面的GFP和内皮细胞膜表面的GFP抗体特异性结合，通过分子牵拉作用使得SynNotch跨膜段的构象发生变化，暴露出酶切位点，γ-secretase酶将跨膜段切断，位于胞内段的tTA游离到胞浆中，进入内皮细胞的细胞核中发挥转录调控的作用。为了显示出最终的转录调控结果，研究人员将tetO-nLacZ作为心肌与内皮细胞相互接触的报告基因小鼠，得到Tnnt2-mGFP;Cdh5-GFP-N-tTA;tetO-nLacZ三基因型小鼠。tetO-nLacZ受到tTA调控从而激活nLacZ表达。当心肌与内皮细胞接触后，tTA从内皮细胞膜上释放并进入细胞核，结合tetO转录调控序列，激活nLacZ的表达，通过X-gal染色显示出与心肌细胞接触的内皮细胞为蓝色，验证了该系统的可行性。随后，研究人员进行了系统优化，引入了tetO-tdT荧光报告基因小鼠用于检测细胞之间的接触，可以更加方便荧光成像和细胞分选。值得注意的是，当两细胞分开后，SynNotch停止激活，细胞膜上的tTA将不再入核，同时，游离的tTA以及报告蛋白会逐渐代谢减少，受体细胞将很快失去报告蛋白标记。因此，gLCCC反映的是细胞之间的实时接触信息。

　　邻近细胞遗传标记技术指示心肌细胞与内皮细胞之间的相互作用

　　为了让SynNotch的激活转变为永久性的遗传改变，研究人员引入了Cre-loxP同源重组系统。当Cre-loxP发生同源重组后，两个loxP之间的序列会被切除，报告基因可以永久性地表达。当受体和配体细胞相互接触后激活SynNotch信号通路，与tetO-nLacZ和tetO-tdT类似，tetO-Cre工具小鼠受到tTA的调控，受体细胞表达Cre，作用于报告基因R26-tdT，从而实现受体细胞的永久示踪，该技术称作gTCCC (genetic Tracing of Cell-Cell Contact)。研究人员以心肌细胞作为配体细胞（Tnnt2-mGFP），内皮细胞作为受体细胞（Cdh5-GFP-N-tTA），利用gTCCC研究胚胎发育过程中这两类细胞之间的相互作用。从小鼠胚胎E9.5到出生后，心内膜垫逐渐重塑形成心脏瓣膜，如左心室的二尖瓣，此时瓣膜表面的心内膜内皮细胞已经没有和心肌细胞接触，瓣膜中由心内膜来源的间充质细胞不仅远离心肌细胞，而且也不表达Cdh5基因，然而无论是瓣膜的内皮细胞还是间充质细胞都持续表达tdTomato，证明曾经激活过SynNotch的内皮细胞及其子代细胞都经过Cre-loxP介导的遗传操作，实现永久性的示踪标记。此外，研究人员发现gTCCC示踪的心脏内皮细胞会在胚胎发育过程中迁移到肝脏，参与形成肝脏的血管网络。这部分内皮细胞在肝脏中会持续存在，对于维持肝脏的正常功能可能具有重要作用。gTCCC具备较大的扩展性，可以利用Cre-loxP重组进行基因敲除或过表达，实现体内跨细胞遗传操作，从而改变接触细胞的表型和命运。

　　邻近细胞遗传示踪技术追踪心脏内皮细胞向肝脏迁移

　　接下来研究人员利用该技术研究了肿瘤血管新生的过程。在肿瘤发生过程中，周围组织的血管会迁移进入肿瘤，为肿瘤生长提供养料和氧气。和肿瘤细胞之间的相互作用会使血管内皮发生基因及表型转变，从而具备一定特性。研究人员利用gTCCC研究肿瘤细胞和血管内皮细胞之间的相互作用。他们在TC-1和LLC肿瘤细胞系中过表达mGFP，皮下注射到受体小鼠Cdh5-GFP-N-tTA;tetO-Cre;R26-tdT中。研究人员发现，肿瘤中几乎全部的内皮细胞被标记为tdT。而且，伴随着肿瘤的生长，肿瘤内部的血管可以迁移到肿瘤外包膜组织中。转录组测序结果表明，这些曾经与肿瘤细胞相互接触过的迁移进入肿瘤外包膜中的内皮细胞具有较强的血管新生、细胞黏附、免疫调控、应对VEGF刺激等的特性。因此，gTCCC对肿瘤血管新生和微环境的研究提供了新的遗传学技术。

　　邻近细胞遗传示踪技术追踪肿瘤细胞与血管内皮细胞间的动态相互作用

　　进一步地，为了拓展邻近细胞遗传学的应用范围，研究人员构建了由Cre重组酶诱导的配体细胞小鼠R26-mGFP，搭配特定细胞类型的Cre小鼠品系，特异性地使该类型细胞表达mGFP，成为配体细胞。同时，研究人员也构建了由Cre重组酶诱导的受体细胞小鼠H11-GFP-N-tTA，通过Cre小鼠使特定类型细胞表达GFP-N-tTA，成为受体细胞。基于以上实验结果，科研人员更进一步地对系统进行精简和优化，构建了Tigre-synNotch小鼠，将序列tetO-tdT-insulator-CAG-loxP-GFP-N-tTA-pA-loxP-mGFP插入到小鼠基因组Tigre位点。在该小鼠中，所有细胞都会表达GFP-N-tTA可以作为受体细胞。而当搭配特定Cre小鼠时，Cre重组酶会在基因组上切掉GFP-N-tTA-pA序列，使Cre阳性的细胞表达mGFP，成为配体细胞，所有Cre阴性的细胞保持着受体细胞的状态，因此，能够利用Tigre-synNotch标记和特定细胞接触的所有其他细胞。

　　综上，该研究的亮点在于开发了实时监测并遗传示踪小鼠体内细胞间相互作用的新技术—gLCCC和gTCCC，以一种全新的细胞谱系追踪和基因操作技术研究体内邻近细胞间的相互作用，大大提升对细胞之间交流的研究水平和精度，为深入探求体内细胞命运可塑性提供重要技术手段；此外，利用该技术揭示了在小鼠早期胚胎发育中心脏内皮细胞迁移到肝脏形成肝脏的血管；描述了肿瘤细胞与血管内皮细胞之间的相互作用，发现肿瘤血管向癌旁组织生长的现象，为肿瘤的基础研究提供了新的技术支持和研究发现。

　　邻近细胞遗传学技术。（A）小鼠胚胎中心肌细胞表达SynNotch配体（绿色），内皮细胞表达SynNotch受体（紫色）。（B-C）新生小鼠心脏中，表达SynNocth配体的心肌细胞（绿色，B），利用gLCCC标记实时接触心肌细胞的内皮细胞（蓝色，C），利用gTCCC示踪接触过心肌细胞的内皮细胞（红色，D）。

　　中国科学院分子细胞科学卓越创新中心博士后张少华和副研究员赵欢博士为该论文的共同第一作者，周斌研究员为该论文通讯作者。

　　专家点评

　　杨晓（研究员，国家蛋白质科学中心 (北京）)

　　多细胞生物，特别是哺乳动物的生长发育和稳态维持是一个非常复杂和高度协调的过程。一方面，细胞内遗传物质的表达水平决定细胞的分化命运、细胞特异的形态结构和行为特征。另一方面，多细胞生命依赖于细胞间的协同。各种细胞类型通过细胞间相互作用和细胞间通讯，连接形成多细胞结构，共同协调生物体个体发育和稳态维持。细胞间通讯通常由蛋白质相互作用介导，包括配体-受体、受体-受体和细胞外基质-受体相互作用。接受信号的细胞通过內源受体触发下游信号转导，导致转录因子活性和基因表达改变，调节细胞形态和功能特征甚至决定细胞的命运转变。利用遗传学技术示踪细胞间通讯将极大地增进我们对从胚胎发育到肿瘤发生等各种基本生理和病理过程的理解。传统的遗传学手段主要针对细胞自身DNA进行操作，比如经典的Cre–LoxP重组技术介导的遗传谱系示踪、基因敲除等，但如何有效地示踪细胞之间的相互作用在技术层面上依然面临较大的困难和挑战。

　　2022年12月2日，中科院分子细胞科学卓越创新中心的周斌研究组在Science上发表题为Monitoring of cell-cell communication and contact history in mammals的研究论文。在该项工作中，研究人员利用人工合成Notch信号通路（synNotch）的技术，并结合传统遗传学手段，首次建立了体内邻近细胞遗传学技术，更加精准地指征相互接触的细胞，并永久地记录发生过接触的细胞，实现邻近细胞命运的示踪。此项工作的亮点在于建立了一套设计严谨、简易直观、可调控的邻近细胞遗传技术，可以在单细胞水平揭示邻近细胞的命运及其调控机制。邻近细胞遗传学技术的建立，突破了传统遗传学手段只能针对细胞自身的局限，首次实现了体内跨细胞的遗传学研究，是领域内一项重大技术突破。这一研究成果具有广泛适用性，势必推动细胞互作相关科学领域的探索。例如，该技术可以用于研究微环境细胞对干细胞的影响、上皮细胞屏障、免疫细胞的相互作用、神经元接触、癌细胞之间及其与邻近免疫细胞之间的通讯等等。此外，干预组织器官不同类型细胞间通讯可能为疾病治疗提供全新的策略。

　　原文链接：

　　https://doi.org/10.1126/science.abo5503

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