AntibodyPlus之GlueTAC：当纳米抗体遇上PROTAC

　　近日北大相关研究团队在化学类顶级期刊《美国化学会志》（JACS)上发表了名为Covalently Engineered Nanobody Chimeras for Targeted Membrane Protein Degradation.该文章中的GlueTAC是继LYTACs、 AbTACs之后，抗体和PROTACs的再一次结合。

　　传统的治疗性抗体是通过在细胞表面阻碍配体-供体的相互作用，从而阻止相应细胞内的信号发挥作用进而达到治疗目的。但是抗体的这种作用会逐渐失去，因为有些细胞在治疗过程中会产生非供体依赖的受体激活功能，因此，如何有效的降解细胞表面的受体是目前药物开发的一个重要方向。

　　PROTACs(Proteolysis targeting chimeras)的发展为致瘤蛋白的降解提供了新的希望，传统的PROTACs主要是降解细胞内的靶点，但是近年来逐渐发展的一些抗体和PROTACs概念相结合的技术使得靶向膜表面蛋白的降解成为可能，如LYTACs(Lysosome-targeting chimaeras)和AbTACs(antibody-based PROTACs)。

　　LYTAC技术主要是通过劫持溶酶体的降解途径，利用修饰的抗体结合靶标后将靶标蛋白带入溶酶体进行降解，抗体首先需要进行修饰—含有甘露糖-6-磷酸化支链N糖原，修饰后的抗体通过甘露糖-6-磷酸支链与细胞膜表面的IGF2R（阳离子-非依赖甘露糖-6-磷酸受体）结合，IGF2R是一种细胞表面的溶酶体靶向受体，主要作用是介导蛋白质向溶酶体的转运及后续的降解。

　　图1. LYTACs作用示意图（参考文献2）

　　AbTACs则主要是构建了能够结合膜蛋白和RNF43（RNF43是一个单次跨膜的E3连接酶，包含膜外结构域，跨膜结构域和RING细胞内结构域）的双特异抗体。该双特异抗体能够结合RNF43的细胞外结构域，相当于PROTAC三连体中能够招募E3连接酶的E3连接酶受体；结合靶标蛋白的Fab部分为靶标蛋白的受体，Fc部分为linker。如下图所示，当双抗AC-1结合RNF43和PD-L1后，通过胞吞进入细胞并被溶酶体降解。

　　

　　图2. AbTACs结构及作用原理（参考文献3）

　　LYTACs和AbTACs虽然能从一定程度上降解膜表面的蛋白，但是其降解效率可能会受到膜表面相关受体的表达的影响，如IGF2R和RNF43。而且这两个技术平台中所用的抗体都为分子量较大的IgG类抗体，较大的分子量可能会影响抗体被内吞的效率。针对以上问题，我国的研究学者构建了不依赖受体内吞，且分子量较小的技术平台----GlueTAC。

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　　GlueTAC的元件

　　GlueTAC主要由两部分组成：1）可以特异性结合抗原的纳米抗体--Gluebody，该纳米抗体经过非天然氨基酸修饰，可以与抗原不可逆的结合（正常抗体和抗原的结合是结合和解离的平衡状态，但是Gluebody与抗原结合后发生反应形成共价键，因此抗体对抗原的结合不存在解离的过程）；另外，纳米抗体大小仅15Kda，其仅为常规抗体的十分之一，较小的分子量使其更容易穿过细胞膜；2）CPP-LSS:其中CPP（cellpenetrating peptide）是含有9个精氨酸的穿模肽，其主要功能是促进Gluebody进入细胞；LSS（lysosomal sorting sequence）为NPXY四肽的溶酶体分选序列，该序列存在于多种跨膜蛋白中，其主要是通过和网格蛋白相互作用并通过网格蛋白介导的胞吞进入细胞并转运到溶酶体，其中X为任意氨基酸。

　　

　　图3. GlueTAC结构及作用示意图（参考文献1）

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　　Gluebody的构建

　　Gluebody与靶标抗原发生的共价反应主要是通过Gluebody中的非天然氨基酸(PrUAAs)和抗原中的氨基酸发生反应，该反应基于邻近交联反应(proximity-enabled cross-linking reaction)。为了找到合适的位点，研究者利用大肠杆菌表达含有非天然的PD-L1纳米抗体(KN035)，非天然氨基酸FSY或者BrC6K的突变位点主要位于CDR3的11个氨基酸(这些位点的选择主要是基于抗体抗原复合物的结构及其中氨基酸的距离，下图A)。

　　经过非天天氨基酸修饰突变的Gluebody与抗原PD-L1混合，并利用还原性SDS-PAGE进行鉴定，能形成共价键的复合物在还原条件下保持复合物的大小，而通过非共价键结合的复合物在还原条件下形成抗体和抗原两条带。共价结合的复合物利用酶切消化，并通过质谱（肽图）鉴定其非天然氨基酸的突变位点（下图B和C）。

　　经过检测发现，仅L108FSY的Gluebody可以与抗原PD-L1形成共价键连接的复合物，并且抗体/抗原比为2:1时，在5h后，多数抗体和抗原形成复合物（D-F）。

　　

　　图4. Gluebody筛选流程及鉴定（参考文献1）

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　　GlueTAC的降解途径

　　Gluebody和CPP-LSS通过分选酶A（sortase）共价连接形成GlueTAC。GlueTAC能够有效的降低细胞表面的PD-L1的表达，并且与对照组的NbTAC(抗体与抗原以非共价键结合)相比，GlueTAC有更强的降解表面抗原的能力（下图A和B）。在GlueTAC处理过程中加入蛋白酶抑制剂MG132和自噬-溶酶体抑制剂氯喹（CQ），结果表明蛋白酶抑制剂MG132对PD-L1的降解没有影响，而自噬-溶酶体抑制剂氯喹（CQ）可以导致抗体/抗原复合物的积累，这表明GlueTAC对膜表面蛋白的降解主要是通过溶酶体路径（下图C）。

　　图5. GlueTAC的降解途径（参考文献1）

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　　GlueTAC对免疫系统的激活及对肿瘤的抑制

　　在体外实验中，GlueTAC处理细胞后可以有效的激活T细胞。与atezolizumab和Gluebody相比，GlueTAC有更强的激活作用。这表明，虽然阻断PD-1/PD-L1的相互作用可以在一定程度上激活免疫系统，但是如果降解PD-L1，从根本上消除其对免疫系统的抑制，则可以达到更好的效果。该结论同样在体内实验中得到了验证，瘤内注射不同的药物后，与对照组相比，GlueTAC有更好的抑制肿瘤的效果。

　　

　　图6. GlueTAC体内、外效果（参考文献1）

　　总结

　　穿模肽（CPP）和溶酶体分选序列（LSS）能够使得GlueTAC在结合抗原后穿过细胞膜并被溶酶体降解，因此与LYTACs和AbTACs相比，其在一定程度上解除了细胞相关受体表达对药物药效的影响，而且与LYTACs和AbTACs相比，GlueTAC是基于纳米抗体构建的，因此其分子量更小，使得抗体/抗原复合物的渗透性更好，而且GlueTAC与抗原的结合是以不可逆的共价键形式，从而增加对细胞表明相关抗原降解的效率。

　　值得一提的是，华人抗体协会在今年年会前夕隆重推出AntibodyPlusTM（又称为抗体加TM, Antibody+TM和抗体+TM）概念，其涵盖了抗体的各类复合药物（下图）。而本文介绍的GlueTAC应该隶属于抗体+蛋白/多肽家族。

　　

　　图7. AntibodyPlusTM

　　参考文献

　　1、Heng Zhang,Yu Han, Yuanfan Yang et al. Covalently Engineered Nanobody Chimeras for Targeted Membrane Protein Degradation. JACS 2021

　　2、Steven M. Banik, Kayvon Pedram, Simon Wisnovsky et al, Lysosome-targeting chimaeras for degradation of extracellular proteins. Nature 2020

　　3、Adam D. Cotton, Duy P. Nguyen, Josef A. Gramespacher et al, Development of Antibody-Based PROTACs for the Degradation of the Cell-Surface Immune Checkpoint Protein PD-L1

　　作者 大脸猫

　　审阅 王守业

　　编辑 董晓东

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