Nature：Fc改造增强抗体药物ADCC活性和半衰期的研究简述

　　前 言

　　目前，全球范围内已超过100多种抗体类药物获批上市，肿瘤、自身免疫性疾病、炎症等疾病治疗领域已取得了令人瞩目的进展。抗体在临床治疗、体外诊断、科学研究等领域发挥重要作用。

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　　抗体结构和作用机制

　　众所周知，抗体的结构呈Y字形，分为两部分区域：Fab臂和Fc尾。Fab臂识别肿瘤细胞或肿瘤微环境（TME）中非肿瘤细胞中的游离分子或细胞表面受体。Fc尾与效应细胞结合后引起细胞杀伤作用。

　　

　　抗体及FC结构图（来自参考文献）

　　Fab臂决定抗体的特异性。Fc尾与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（ADCP）以及补体依赖的细胞毒性作用（CDC）及药物半衰期都密切相关。Fab臂和Fc尾共同决定抗体药的疗效和安全性，因此开发抗体药物既要考虑Fab臂的表位、特异性和亲和力，也要充分思考Fc尾的生物学活性、理化性质与目的效应功能的关联，从而将抗体药的疗效与安全性最大化。

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　　如何增强抗体药物ADCC活性

　　ADCC是抗体药杀伤肿瘤细胞或病原微生物的重要机制之一，已知NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等参与ADCC作用。部分研究表明Fc尾与FcγRIIIA的高亲和力有益于抗体药的疗效。

　　

　　增强ADCC活性的开发策略主要有：

　　1. 改造抗体Fc尾序列，提高抗体与FcγRs的亲和力。如抗体Fc尾改造Gly236Ala、 Ser239Asp、Ala330Leu和Ile332Glu (GASDALIE)，可以将抗体与FcγRIIIA的亲和力提高20倍，而对抗体与FcγRIIB的亲和力影响极小。

　　2. 调整抗体Fc的糖基化修饰。如抗体平分型GlcNAc糖基化修饰可显著提高ADCC活性，核心岩藻糖和唾液酸的缺失也可提高抗体的ADCC活性。CHO细胞稳定表达外源GnTIII可协助抗体进行平分型GlcNAc糖基化，或敲除CHO细胞的FUT-8基因（或发酵时添加糖苷酶抑制剂kifunensine），都可作为提升抗体ADCC活性的方式。

　　3. 双特异/多特异抗体也是加强抗体药ADCC活性的重要方式。

　　未来联合治疗将为增强ADCC提供更多的可能。如激活CD40，降低或阻断Fc与FcγRIIB的结合（FcγRIIB抑制ADCC生物活性）；或上调效应细胞上的Fc受体表达水平。另外，通过改造FcγRIIIA (Ser197Pro)来降低ADAM17对其清除，从而提高免疫细胞表面FcγRIIIA的丰度，iPSC来源的低清除FcγRIIIA的NK细胞为联合治疗提供另一个思路。

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　　如何提高抗体药物半衰期

　　提高抗体药的半衰期，降低清除效率，可扩大治疗窗口期、降低给药频率，从而提高药物的疗效。

　　

　　目前主要有3种方式可提高抗体药半衰期：

　　1. 增强抗体Fc尾与FcRn的亲和力。通过改造Fc尾，提高pH5.8亲和力，而基本不改变pH7.4亲和力，改造后的抗体药半衰期得到有效提高。在众多的改造方案中，DHS (L309D/Q311H/N434S)活性展现出了较大的优势，不仅提高半衰期，并保持了FcγRs结合能力以及ADCC活性。

　　2. 开发结合抗原pH依赖的抗体。TMDD（靶点介导的药物处置模型）消除快，半衰期短，导致血浆/血清抗体浓度低。开发pH敏感抗体成为克服TMDD消除快的可能。在这个模型下，抗体与抗原结合后内化至细胞的核内体中，pH6的酸性环境下抗体与抗原解离，抗体被FcRn转运回血浆，抗原则被细胞降解。

　　3. 降低抗体的等电点。研究表明负载阳离子分子比负载阴离子分子更易被细胞摄取、吞噬。所以在抗体优化的过程中，降低抗体的等电点是一个有价值方式。

　　临床/上市ADCC增强药物（部分）

　　

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　　Fc受体在抗体药物改造中的作用

　　如上所述，FcR在抗体药物改造中具有重要作用。FcR是一类能够和抗体Fc片段特异结合的细胞表面蛋白，结合不同类型抗体进而诱发免疫反应。抗体的Fc片段和宿主的免疫细胞表面的FcR结合，激活免疫细胞后通过ADCP、ADCC等机制，清除病原微生物或杀伤肿瘤细胞。

　　人体内有两类IgG的Fc受体（FcγR），一类为激活受体，包含 FcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32a)、FcγRIIC(CD32c)、FcγRIIIA (CD16a)和FcγRIIIB (CD16b)；一类为抑制受体，FcγRIIB (CD32b)是唯一发现的Fc抑制受体。

　　

　　为了保证临床疗效和安全性，抗体药需在临床前进行全面的评估。除亲和力和抗原特异性外，还包括ADCC、ADCP及CDC 等效应功能。FcγRs在ADCC、ADCP等效应功能上起到了关键作用，如FcγRIIIA (CD16a)激活NK介导的ADCC，FcγRIIA (CD32a) 和FcγRIIIA（CD16a）激活巨噬细胞介导的ADCP。

　　当然，根据药物作用机理的不同，部分抗体药需要将ADCC/ADCP/CDC等活性降低或完全消除，今天不展开描述。

　　? 义翘神州Fc受体蛋白验证数据

　　义翘神州作为国内生物试剂的龙头企业，提供FcR 精品蛋白，全面支持抗体药物开发。

　　人源FcγRIIIA / CD16a (V176)重组蛋白：10389-H08H1

　　HPLC和SDS-PAGE检测结果：蛋白纯度>95%

　　

　　Purity: >95% as determined by SDS-PAGE & HPLC

　　ELISA检测结果：EC50 is 150-450 ng/mL.

　　

　　Immobilized Human FcγRIIIA / CD16a (V176) recombinant protein (Cat. 10389-H08H1) at 2 μg/mL can bind Human IgG1 (Cat. 10702-HNAC), the EC50 is 150-450 ng/mL.

　　BLI检测结果：亲和力常数为0.83 μM

　　

　　Loaded Human FcγRIIIA / CD16a (V176) recombinant protein (Cat. 10389-H08H1) on His1K Biosensor, can bind Bevacizumab (IgG1) with an affinity constant of 0.83 μM as determined in a BLI assay (ForteBio Octet Red384).

　　SPR检测结果：亲和力常数为0.31 μM

　　

　　Captured Human FcγRIIIA / CD16a (V176) recombinant protein (Cat. 10389-H08H1) on Anti-His Chip can bind Bevacizumab (IgG1) with an affinity constant of 0.31 μM as determined in an SPR assay (Biacore T200).

　　义翘神州FcR重组蛋白产品

　　货号

　　FcR 名

　　CD名

　　纯度及活性

　　10256-H08H

　　FcγRI

　　CD64

　　>95%，Active

　　10374-H08H

　　FcγRIIA

　　CD32a (R167)

　　>95%，Active

　　10374-H08H1

　　FcγRIIA

　　CD32a (H167)

　　>95%，Active

　　10259-H08C

　　FcγRIIB/C

　　CD32b/c

　　>95%，Active

　　10389-H08H

　　FcγRIIIA

　　CD16a (F176)

　　>95%，Active

　　10389-H08H1

　　FcγRIIIA

　　CD16a (V176)

　　>95%，Active

　　11046-H08H1

　　FcγRIIIB

　　CD16b (NA1)

　　>95%，Active

　　11046-H08H

　　FcγRIIIB

　　CD16b (NA2)

　　>95%，Active

　　CT009-H08H

　　FcRn

　　>95%，Active

　　注：纯度为SDS-PAGE检测结果

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　　【参考资料】

　　1. Narvekar, et al. ADCC enhancement: A conundrum or a boon to mAb therapy? Biologicals : journal of the International Association of Biological Standardization 79, 10-18(2022).

　　2 Musolino, et al. Role of Fcγ receptors in HER2-targeted breast cancer therapy. Journal for immunotherapy of cancer 10, e003171 (2022).

　　3 Gillis, et al. Contribution of Human FcgammaRs to Disease with Evidence from Human Polymorphisms and Transgenic Animal Studies. Frontiers in immunology 5, 254 (2014).

　　4 Haraya, Tachibana and Igawa. Improvement of pharmacokinetic properties of therapeutic antibodies by antibody engineering. Drug metabolism and pharmacokinetics 34, 25-41 (2019).

　　5 Lee, et al. An engineered human Fc domain that behaves like a pH-toggle switch for ultra-long circulation persistence. Nature communications 10, 5031 (2019).

　　6 Dixon, Wu, and Walcheck. Engineering Anti-Tumor Monoclonal Antibodies and Fc Receptors to Enhance ADCC by Human NK Cells. Cancers 13 (2021).