实验技能丨免疫共沉淀的原理与方法

　　

　　生物个体的许多生命活动过程都与蛋白质相互作用有密切的联系，因此随着生命科学研究的不断深入，研究蛋白质相互作用成为了揭示各种生命活动机制的必要步骤。迄今已经发展出了多种用于研究蛋白质相互作用的技术和方法，例如免疫共沉淀，酵母双杂交技术，双分子荧光互补技术，荧光共振能量转移技术和串联亲和纯化联合质谱分析的方法等。

　　Co-IP 是一种基于抗原与抗体的专一性结合的实验方法，广泛应用于检测生理条件下蛋白质与蛋白质之间的相互作用。这种方法常用于鉴定两种目标蛋白质是否存在相互作用，也可以用于确定某种已知蛋白质和其他未知蛋白质之间的相互作用。

　　Co-IP 的基本原理：首先在非变性条件下使用温和的细胞裂解液裂解细胞，此时存在于完整细胞内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用被保留了下来。随后向细胞裂解液中加入偶联某种抗体的琼脂糖珠并进行孵育。当蛋白质A 被其抗体特异识别并结合后，A 可以与其抗体免疫沉淀，那么在细胞内与A 存在相互作用的蛋白质或者蛋白复合物B 也能沉淀下来。利用洗脱液洗脱沉淀下来的蛋白，通过Western blotting 对这些蛋白进行鉴定和分析。

　　

　　实验方法

　　收集已同时表达蛋白X和蛋白Y的细胞。

　　吸净细胞培养液，用PBS小心漂洗一次，然后加入500 μl预冷的Lysis/IP buffer，于冰上放置15 min，每隔几分钟晃动一次。

　　将细胞裂解液转移至1.5 ml EP管内，于4℃，13,000 rpm离心 5 min。

　　将离心后的上清留取少量样品后（所留样品加入等体积的2×蛋白上样缓冲液，混合后，于100℃煮沸5 min，离心后放置-20℃保存备用），对蛋白含量进行定量，补充Lysis/IP buffer 至1 ml左右，然后分别加入50 μl 50％的Progein G beads，于4℃环境下，将EP 管固定到混匀器上使混匀器匀速颠倒旋转1 h 以除去Protein G beads 非特异结合的蛋白。

　　于4℃，13,000 rpm 离心 5 min，将上清液再次转移至1.5 ml EP管内，加入1 μl的正常小鼠IgG或者是FLAG单克隆抗体，于4℃环境下，将EP管固定到混匀器上使混匀器匀速颠倒旋转1 h，使抗体与蛋白进行特异结合。

　　加入50 μl 50％的Protein G beads，于4℃环境下，将EP管固定到混匀器上使混匀器匀速颠倒旋转1 h，使Protein G beads与抗体结合。

　　于4℃，13,000 rpm离心 5 min，弃上清，然后用Lysis/IP buffer洗涤三次，每次都在4℃环境下，将EP管固定到混匀器上使混匀器匀速颠倒旋转15 min。

　　最后一次洗涤完毕，弃上清，管中只剩下beads，加入25 μl的2×蛋白上样缓冲液，混合后，于100℃煮沸5 min，离心后即可上样SDS-PAGE胶或者放置-20℃保存备用。

　　注意事项

　　细胞裂解要采用温和的裂解条件，避免破坏细胞内存在的蛋白间相互作用，裂解、洗涤时需使用非变性裂解液，如 NP-40 和 Triton X-100。

　　由于不同细胞裂解条件不一样，建议通过预实验来确定最佳条件。

　　抗体的选择十分重要，选经过 IP 验证的抗体，可以减少假阳性概率。

　　注意抗体/缓冲液的比例，抗体稀释过度不利于后续抗原抗体结合；而抗体过多就不能完全沉降在固相基质上，残存于上清。

　　操作时，为了避免损伤 beads，使用大口径或截短枪头进行加样。

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