制备单克隆有方法有哪些？

　　目前制备大量单克隆抗体的方法主要有两种：一种是动物体内诱生法；另一种是体外培养法。

　　背景

　　BACKGROUND

　　困惑

　　PUZZLED

　　体外培养法有哪几种培养方式？何谓无血清培养？

　　探索

　　在体外培养法中，目前各个实验室普遍采用细胞单层法，就是将杂交瘤细胞加入培养瓶中，用完全培养基培养，细胞浓度以1.0X100~2.0X106个/mL为宜，然后收集培养上清液。如果希望在体外高效率地大量制备单克隆抗体，就必须高密度培养单克隆抗体细胞株，充分利用培养基的立体空间。单位体积内细胞数量越多，产生的单克隆抗体就越多，浓度就越高，产量就越大。随着细胞培养的原理和方法不断完善，单克隆抗体细胞规模化培养技术日趋成熟。目前，主要有两大类单克隆抗体细胞大规模培养系统：一是细胞悬浮培养系统(cell suspension culture system)，采用发酵罐式的旋转瓶，包括常规的悬浮培养和新型的微载体培养；二是细胞固定化培养系统(cell immobilization culture system)，包括中空纤维细胞培养法和微囊化细胞培养法。

　　悬浮培养贴壁依赖性细胞目前多采用转瓶培养，它常用于小量培养到大规模培养的过渡阶段，通过转瓶不断旋转使细胞呈悬浮状态，在培养瓶中均匀分布，充分利用养分，并扩大气液接触面，便于氧气的传递。而工业化、商业化大规模悬浮培养多采用生物反应器，其深层培养可分为分批式、流加式、连续式和灌注式等。

　　微载体培养法是应用一种对细胞无害的颗粒作为细胞生长的介质，细胞附着于其表面生长，在持续搅动作用下微载体悬浮于培养液中。微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，具有贴壁培养和悬浮培养的优点。

　　中空纤维细胞培养法是通过模拟细胞在体内生长的微环境，使细胞不断生长繁殖。中空纤维是一种微细的管状结构，壁为极薄的超滤膜，使无血清培养基携带着氧气在管内灌流，而管壁外则供细胞贴附生长。由于中空纤维的孔径对细胞和大分子物质有滞留作用，故营养物质和代谢废物可以自由出入其孔径。该培养系统占地空间小，生产成本低，培养的细胞密度大并可获得高质量的抗体。

　　微囊化细胞培养法是先将单克隆细胞包埋在具有亲水性的半透膜微囊里，然后将此微囊放置在培养液中进行培养。微囊内部是微小培养环境，它将有效保护细胞免受机械损伤，故细胞生长良好，细胞密度高，可获得高浓度的单克隆抗体。

　　单克隆抗体细胞在体外培养时通常使用合成培养基，再添加胎牛血清配成完全培养基。但是血清中成分复杂，这对纯化单克隆抗体来说是个难题， 而低纯度的单克隆抗体用于临床治疗可能导致一系列变态反应。同时，血清来源有限，各批量间质量差异大，直接影响杂交瘤细胞的连续性培养。另外，血清中潜藏的支原体是污染动物细胞的隐形杀手，不易察觉，而且其价格成本昂贵。为了克服血清的这些缺点，应用无血清培养基将会成为杂交瘤细胞培养的一种新趋势。

　　无血清培养(serum free medium,SFM)的实质就是有针对性地使用添加剂来代替血清，维持杂交瘤细胞在体外的生长。采用无血清培养基培养杂交瘤细胞制备单克隆抗体，便于抗体纯化，有利于规模化、标准化生产，同时降低细胞污染的概率。但无血清培养的细胞新陈代谢较弱，同时无血清培养基缺乏血清中保护细胞免受环境机械损伤的细胞因子等。尽管如此，随着无血清培养基的不断优化、完善，最终无血清培养基肯定会成为理想的杂瘤细胞培养基。

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