抗体工程改造研究，盘一盘 FcRn“新生儿”Fc受体（上篇）

　　在全球生物制药急速扩张的大背景下，抗体及抗体工程药物在疾病的诊断，治疗和预防方面所占的比重迅速增长。长期以来，抗体药物不可避免的高研发成本所产生的昂贵售价并不很亲民，并且相对频繁的注射给药也给患者带来诸多不便。抗体半衰期是抗体药物代谢动力学的关键，因此，延长抗体半衰期成为抗体工程改造的重点之一。本期小编给大家分享，基于FcRn功能开发的药物研究(延长抗体药物半衰期和自身免疫疾病治疗)。

　　一、关于抗体

　　抗体是由B淋巴细胞对外来分子或抗原刺激后产生的Y型免疫球蛋白，其包含两个完全相同的抗原结合片段(fragment antigen binding，Fab)和一个可结晶片段(fragment crystallizable， Fc)。人体内表达的免疫球蛋白(Ig)主要有5种：IgM、IgA、IgD、IgG、IgE。其中，血清中含量最多的免疫球蛋白是IgG，也是抗体药物的主体。

　　抗体是免疫系统的核心组成部分，可以预防和控制病原体的传播，同时对再次感染提供长期保护。

　　二、抗体药物重要作用机制

　　抗体的结构决定其作用机制，抗体的基本结构是由两条重链(Heavy chain)和两条轻链(Light chain)，通过链间的二硫键连接而成，呈“Y”字型。

　　Fab段

　　其中，Y型结构上面的两个臂为Fab段(VH和VL)(见图1)可以识别游离分子(如VEGF、TNF等)和细胞表面的受体(如CD20、CD19等)，达到对外来入侵物(病毒，细菌等)及自身异常细胞如癌细胞的特异性识别，进而调控如癌细胞抗原相关的下游信号通路，从而抑制癌细胞生长，诱导癌细胞分化和凋亡。

　　Fc段（CH2和CH3）

　　Fc段决定抗体的效应功能，巨噬细胞、NK细胞等细胞表面的Fc受体为对免疫球蛋白Fc部分C末端的受体。免疫球蛋白(Ig)与抗原结合后，抗体的Fc段变构，与细胞膜上的Fc受体结合，产生各种生物效应，包括抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)，以及补体依赖的细胞毒性作用(CDC)等进一步提高单克隆抗体的疗效。

　　IgG受体主要有FcRn和FcγRs。其中，FcγRs /C1q与可结晶片段(Fc)区域(图1)相互作用的位点位于下铰链上的CH2(绿色矩形)；FcRn与Fc区域相互作用的位点位于CH2、CH3的界面(黄色矩形)。

　　

　　图1：免疫球蛋白Y整体结构示意图及其与FcγRs/C1q和FcRn的结合区域

　　此外，FcRn与IgG的结合呈pH依赖性(pH dependence)，这是FcRn实现IgG的跨膜转运及维持血浆IgG水平稳态的基础。

　　三、基于FcRn功能开发的药物设计

　　新生儿Fc受体(FcRn)是一个非常优质的载体膜蛋白，广泛参与了体内各种生物学及免疫过程。基于FcRn的药学研究主要集中与融合蛋白，IgG的Fc段工程化改造以及用于靶向FcRn药物递送应用的研究和FcRn抗体的研发。

　　Fc与FcRn以pH依赖的方式相互作用，可以减缓IgG的降解，延长其血清半衰期；抗体Fc区域的缺失也大大缩短了其血清半衰期，削弱了其药效作用。

　　除了半衰期评估，FcRn作为靶点的潜力也相当巨大，主要因为FcRn的高亲和力尤其对IgG介导自身免疫性疾病造成有害影响。靶向FcRn，抑制FcRn循环可使IgG分解代谢增强，导致整体IgG和致病自身抗体水平降低，有望降低IgG引起的自身免疫异常，从而达到治疗自身免疫疾病的作用。

　　FcRn的结构与功能

　　FcRn(neonatal Fc receptor，新生儿受体)是一种位于细胞膜表面的IgG抗体受体，其蛋白结构和MHC-I类分子类似，其结构包含由α链(α1,α2和α3)和β2微球蛋白组成的异二聚体；FcRn可以与IgG以及白蛋白结合，但是结合的位点不同，分别位于α链的内测和外侧(图2)。

　　

　　图A 图B

　　图2：FcRn与IgG及白蛋白结合的结构示意图

　　由图2(A/B)结构示意图可见：人IgG1(红色)通过其Fc端CH2–CH3域与FcRn的α2域(绿色)和β2M(灰色)的N端相结合。人血清白蛋白(紫色)在其他结合域与FcRn结合。平衡条件下，FcRn与IgG以2:1的比例结合，不平衡条件下，FcRn与IgG以1:1的比例结合；白蛋白在其他位点与FcRn以1:1的比例结合。由此可见，FcRn与IgG和血清白蛋白的结合位点并不相同，因此FcRn与IgG结合不会受到血清蛋白的干扰。

　　FcRn与抗体半衰期的关系

　　IgG在人体内半衰期长达2-4周，影响半衰期主要归因于FcRn介导的再循环机制，而这种机制是通过IgG的Fc片段和血清白蛋白与FcRn的pH依赖性结合而实现。在酸性条件下(pH6.0-6.5)，FcRn结合IgG，在中性及弱碱性条件下(pH7.0-7.5)发生解离(图3)。

　　

　　图3：FcRn对IgG的循环示意图

　　内皮细胞通过形成内吞小泡，将IgG摄取后形成酸化内体。IgG与FcRn结合形成IgG-FcRn复合物。IgG-FcRn复合物通过再循环内体转运到细胞表面，由于细胞外血液的pH值为微碱性pH7.4左右，IgG-FcRn复合物发生解离，IgG重新释放至血液循环中，通过这种受体介导的再循环机制，FcRn有效保护IgG避免在溶酶体中降解，从而延长IgG的半衰期。而酸化内体中未与FcRn结合形成IgG-FcRn复合物的IgG，则在溶酶体内发生降解。应用FcRn对IgG的循环机制延长抗体药物在体内的半衰期是目前应用较广泛的方法。

　　基于上述的循环机制，对抗体的Fc序列进行改造可以进一步优化抗体的药代动力学特征。可以采用氨基酸点突变，噬菌体展示，酵母展示，细胞展示及计算机辅助设计等方法，构建和筛选Fc突变体，优化pH依赖性的Fc-FcRn相互作用，使其在pH6.0条件下结合力更强，而在pH7.4条件下Fc能从FcRn上迅速解离，避免被溶酶体等降解，实现改造的目的。

　　2018年FDA批准了Fc工程化突变体药物Ravulizuma-cwvz，是一种补体C5抑制剂，由Alexion制药公司开发，用于治疗阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)和非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)。该药物是通过对Eculizumab中加入了两个结构变化，在Fc区进行两个氨基酸替换，增强了抗体对人FcRn的亲和力，以创造一种新的长效抗体。Eculizumab需要每2-3周静脉输注一次，增加了输注负担和相关不良事件,而Ravulizumab半衰期长达42天, 患者只需每8周接受1次静脉注射治疗。此外，Xencor的LS变体 (M428L/N434S)，pH6.0 时与FcRn的亲和力提高了11倍, 突变体M252Y/S254T/T256E(YTE)与hFcRn的结合亲和力提高了10倍。使用这些突变技术，MEDI-524-YTE在食蟹猴体内半衰期延长近 4倍。抗体药物motavizumab-YTE在人体内的半衰期可达100天。由此可见，通过FcRn对IgG的循环机制，对抗体的Fc序列的改造可以很大程度上延长药物半衰期，对患者用药可以减少其用药次数。

　　通过上述机制的启发，新为医药根据FcRn对IgG的保护机制，利用ASyNaL纳米抗体筛选平台(噬菌体展示技术)，对Fc段进行改造，构建Fc突变体文库，通过FcRn对Fc突变体文库进行筛选，获得了一系列与FcRn亲和力相对较高的Fc突变体，在不同的pH值条件下，通过BLI测定其亲和力。最后筛选到多个高亲和力的Fc突变体。为后续新为医药所筛选到的其他药物延长其半衰期做准备。

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