速查收！15 年 WB 经验教你科研不迷路（视频教学）

　　科研人 习惯把 WB 叫做「玄学」，一不小心很容易出现问题！明明上了两个相同体积的同个样品，可总是这两个泳道的条带趋势不一致。

　　我们给大家准备了图解 WB 标准操作流程，注意事项和相关解决方案，帮助大家轻松获得可靠、线性、定量的实验结果。

　　一、实验操作视频

　　现在不便观看视频的同学，可以先收藏小程序视频。另外，丁香实验还给大家准备了文字版本的操作步骤，接着往下看吧

　　二、实验具体步骤

　　细胞裂解进行蛋白提取的步骤同 COIP 细胞裂解的步骤。

　　制胶：电泳的过程中需要配置分离胶和浓缩胶，每一个胶板大致配 7～8mL的分离胶，3～4mL的浓缩胶。将配置好的分离胶加入到两玻璃之间，注意加入的位置，然后在其上加入 75% 的乙醇，待其自然凝固后将其中的乙醇倒掉，用水轻轻地冲洗，再将浓缩胶倒入其中让其慢慢凝固。

　　为了防止电泳过程中条带的弯曲，在安装电泳仪之前要用两个胶板固定使其平衡。玻璃板低的一侧朝向里面，注意电极正负，电泳之前要在电泳槽中倒入电解液。

　　上样之前要进行上样量的计算，要使所有样品的上样量都保持一致，控制单一变量。上样之前需要煮沸样品，使蛋白裂解。煮沸过之后用小的离心机稍微离心。

　　上样及电泳：先加入Buffer，然后依次加入样品，最后加入2～3 μL 的Marker。打开电源，调至电压至 100V，待 Marker 条带分明时，然后将电压调至 150V，至 Marker 中的红色条带跑到下面为止。

　　转膜：膜需要先用甲醛进行活化，电转液需要提前配置进行预冷。转膜之前膜和胶之间不要有空隙。

　　封闭完之后，加入抗体进行封膜处理，封膜 1 h。

　　取出膜用 TBST 洗 3 次，每次 10 min。

　　加入二抗进行孵育，孵育 1 h后使用 TBST 清洗三次。

　　暗室显影：加入和二抗结合的 AB 液，在发光仪中显色。

　　三、WB实验注意事项

　　1. 电转液需要提前遇冷；

　　2. 电转的过程中的电流不能过高；

　　3. 孵育抗体的时候要提前将气泡赶走；

　　4. 孵育一抗尽量在 4℃ 环境下进行；

　　5. 发光在暗室里进行。

　　四、WB 实验常见疑问解答

　　以上内容来自【】实验专题，如果你是实验小白可以收藏、转发文章，在做实验的时候按照流程一步步操作。

　　虽然 WB 实验较为基础，但也算是易做难精，如果有好的产品加持，一定会事半功倍！

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　　1

　　小鼠Leptin重组蛋白

　　

　　【文献标题】Gab2 deficiency suppresses high-fat diet-induced obesity by reducing adipose tissue inflammation and increasing brown adipose function in mice

　　【出版期刊】Cell Death & Differentiation

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　　2

　　LN521? - 人类重组层粘连蛋白LN521

　　

　　【文献标题】Dynamic blebbing: A botileneck to human embryonic stem cell culture that can be overcome by Laminin-Integrin signaling

　　【出版期刊】Stem Cell Research, 2018

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　　3

　　重组蛋白RANKL，Mouse，AF

　　

　　【文献标题】Mechanism of transepithelial migration of lymphocytes into the milk in porcine mammary glands.【出版期刊】Reprod Immunol. 2021 Oct 29

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　　策划制作

　　策划：丁香实验

　　配图：丁香实验设计团队