纳米抗体结构特点及其抗原结合活性研究

　　前言

　　       抗体通常可以分为第一代多克隆抗体、第二代单克隆抗体和第三代基因工程抗体。纳米抗体（nanobody，Nb）是一种新型基因工程抗体，又称单域抗体，是通过克隆骆驼科等动物体内含有的天然缺失轻链的重链抗体可变区（variabledomain of the heavy chain of heavy-chainantibody，VHH）得到的。与传统抗体相比，Nb具有相对分子质量小、亲和力高、特异性和稳定性高以及溶解性好、免疫原性低、穿透力强等优势，有利于在免疫化学中用作新型分析试剂。作为抗体行业的新成员，Nb尺寸小却具有亲本抗体的完整抗原结合能力，是传统抗体的有益补充。

　　       现如今Nb已广泛应用于结构生物学、细胞生物学和发育生物学等领域，也逐步应用于小分子生物领域、基因工程及环境监测等，如通过调整抗体空间构象来稳定药物配体、诱导抑制剂的结合以增强抑制作用等，也有研究者将其用作结晶伴侣。然而，Nb结构研究是其应用的基础，目前关于Nb结构与其功能特性之间的关系已有部分报道，但仍需要进一步深入研究。只有更深入更准确地掌握Nb与抗原之间的识别机制，才能通过改造（如随机突变、定点突变或构建多聚体等）提高Nb的结合活性、贮存及反应稳定性，进一步提高其在不同领域的应用潜力。

　　1 纳米抗体的结构特点

　　       Nb由3个高变区域的抗原互补决定区（complementarity-determiningregions，CDRs）和4个框架区域（frameworkregions，FRs）组成，形状扁长且十分紧凑，暴露出的凸形互补位可以进入Abs难以接近的蛋白质表面空洞或裂缝。蛋白质的表面空洞或裂缝通常可以很容易地被Nb的长互补决定区CDR3识别。

　　       由图1（b）可知，Nb与Abs可变区之间最显著的区别在于FR2框架区域中所含氨基酸序列的不同以及CDR1、CDR3区域序列长度不同。相比于Abs，Nb的溶解性更好，因此表达量通常也较高。因为分子量小，亲水氨基酸较多，亲水性较高，加上CDR区之间氢键的相互作用，Nb往往亲和力较高。

　　       此外，VHH只有3 个高变区域，为了提供足够大的600～800 A?2的抗原相互作用表面，VHH中的H环通常比Abs VH中的CDR区更长。从图1（b）中可以看出，Nb CDR1区有所扩大，并且存在扩展的CDR3区。

　　       Nb与Abs的另外一个区别在于两者用于识别抗原的环的数量及形成的空腔不同（图2）。在Abs中，参与抗原识别的结构为VH和VL，二者通常彼此结合以实现特异性识别作用。

　　       由于Nb是单域抗体，故独立存在而自主发挥作用。Nb结构中只有3个高变环，然而仅拥有这3个高变环就已具备与抗原的结合特异性和高亲和力，无需像Abs一样必须有6个CDRs共同作用才可识别抗原。该区域被保守的框架区域所包围，形成的空腔多为形状较小的凸状、凹槽状或口袋状，多与小分子的识别相关联，少数参与大分子的识别。因此，Abs一般只能识别位于抗原表面的结合位点，Nb还可以识别凹陷抗原的结合位点。

　　       总之，相较于Abs，Nb具有三高两低的优势特性，即高亲和力、高稳定性、高表达量，以及免疫原性低、生产成本较低的特性，是近年来生物化学、结构生物学和食品安全免疫分析等领域的研究热点，发展前景广阔。

　　2 纳米抗体结构与抗原结合活性的关系

　　       抗体分子具有可变区域，该可变区域的氨基酸残基所形成的肽链会沿功能区域长轴平行方向往返折叠，形成凹型或口袋状的活性部位。

　　2.1源于不同驼种的Nb亚型与抗原结合活性的关系

　　       骆驼科的生物家族包括驼峰骆驼如单峰骆驼、双峰骆驼等，还有羊驼、骆马和骆马鸟等，目前国内来源于骆驼的Nb研究较多，羊驼来源的Nb研究在国外已有一些进展，但在国内研究相对较少。当骆驼种类不同时，其体内所含的VHH亚型不同。亚型不同所形成的结合界面不同，进而结合特异性也不同。不同的VHH亚家系主要在于不同的CDR区域规范结构。VHH1和VHH2的CDR3序列长度低于传统VH的CDR3平均长度，但仍然保持着高度的可溶性、稳定性和结合抗原的功能性；只有VHH3和VHH4的CDR3序列较长，氨基酸残基数量达到16～24个，远远超过传统VH的氨基酸残基数量（7～9个）。研究表明，单峰驼中CDR3的序列长度达16～18个氨基酸，而双峰驼中CDR3的序列长度可高达18～23个氨基酸，进而也产生了多种不同程度的抗原结合活性。

　　2.2互补位构象与抗原结合活性的关系

　　       骆驼科动物尤其是单峰骆驼中含有多种IGHV基因，而且基本上都有D基因和J基因，即多样性基因和连接基因。在动物体内的B细胞、淋巴细胞生成过程中，IGHV或IGHVH等多种基因混杂在一起，参与V-D-J重排，最终可形成VH或VHH结构域，每种结构域的互补位存在一定差异（图3），其本质就是在没有VL的情况下，通过V-D-J基因重组独立组装，然后结合在一起，产生无数可能的互补位结构，进而形成多种抗原结合位点，因此也产生了多种不同的抗原结合特异性。

　　       VH（或VL）的序列及数量差异可能是互补位多样性的另一个原因。研究表明，多样性是通过可变域VH、VL的序列变异产生的。此外，CDR1、CDR2也会出现序列变异现象，因此也会出现互补位的多样性，进而间接影响Nb的抗原结合活性。总体来说，基因重组及序列变异都是通过影响互补位来影响Nb的抗原结合活性的。

　　2.3CDR1-CDR3序列长度、折叠构象与抗原结合活性的关系

　　       Nb高变区域CDR1-CDR3的序列对其抗原结合活性的影响较为复杂，无论是序列长度还是折叠构象，或是高变区N端所含有的氨基酸种类，细微不同均会导致结合活性的较大差异。尤其是CDR环所形成的空腔构象多样性高，所产生的特异性及结合活性也相差较大。此外，还有少部分Nb存在不明显的CDR4区，对其结合活性也有一定影响。

　　2.3.1CDR1、CDR3序列长度与抗原结合活性的关系

　　       从图4（a）可以看出，CDR1区域（H1环）有所扩大，并且存在扩展的CDR3区域（H3环）。扩大的CDR1区域起源于种系基因，突变热点的存在导致VHH向N端延长。序列较长的CDR3区域可能是由于V-D-J重组后功能性VHH域的选择，但也有研究表明是为了补偿轻链缺失的结果，或者是弥补仅3个CDRs对抗原结合稳定性弱的短板。因此，序列更长的NbCDR3区所形成的环通过形成与Abs相类似的相互作用表面，有助于提高Nb复合物的稳定性，并允许Nb进入隐秘的凹表位。

　　2.3.2三个环弯曲折叠形成空腔构象的影响

　　       研究表明，VHHCDRs的结构多样性高于传统VH域。晶体学相关研究表明，Nb的抗原结合环的结构库更大。如图4（c）所示，由于CDR1、CDR2、CDR3区所形成的的环高度可变，这些环在折叠蛋白结构域的一侧形成扩展的结构界面，有利于形成抗原结合界面或互补位，非常适合插入对应抗原分子的沟槽或裂隙内，增大与抗原的相互作用面积，从而产生了多种抗原结合特异性。

　　       总之，VHH形成的空腔多为形状较小的凸状、凹槽状或口袋状，抗原结合能力广泛，可结合种类较多，不仅可识别小分子抗原，也可部分结合大分子蛋白和病毒。

　　2.4CDR4区域与抗原结合活性的关系

　　       在Nb中，除了主要的CDR1、CDR2、CDR3高变区，实际上在CDR2区和CDR3区之间的非高变区FR3中存在着一个比较不明显的互补决定区CDR4，这个区域也含有部分与抗原结合相联系的氨基酸，当CDR4中一些残基缺失时也会影响到Nb的抗原结合特异性。

　　2.5H1环N端氨基酸与抗原结合活性的关系

　　       虽然各种环结构可以形成不同的抗原结合界面，但大多数Nb结构中的长环在FR2区域折叠，形成较平坦的对位表面。虽然结构域中该位置的可变性有所提高，但其参与抗原结合的能力依然受到一定的限制，而扩展的H1环的N端氨基酸通常高度参与抗原识别过程。Mitchell等总结了VHH结构域中存在的氨基酸序列徽标图（图5）。从图中可以看出，H1-H3环均含有较多的与抗原接触的氨基酸，其中在H2环与H3环中分布较为均匀，而在H1环中则主要在靠近N端区域含有较多与抗原接触的氨基酸，这部分氨基酸在参与抗原结合时发挥了较大的作用，因为大部分抗体与抗原结合时，均是N端优先靠近抗原并进行识别，因此N端氨基酸对于最开始的抗原识别过程来说非常重要。

　　3 纳米抗体结构与其稳定性的关系

　　3.1CDR3序列与Nb稳定性的关系

　　       研究表明，Nb可变区域CDR3序列对Nb稳定性影响作用最大。与Abs相比，Nb的CDR3序列较长，CDR3区域是大部分Nb的关键识别区域，与Nb的性质差异和功能发挥有着密切联系。CDR3序列中含有许多氨基酸残基，残基的缺失及半胱氨酸的数量和取代情况均会在一定程度上促使Nb聚集或解聚，进而影响Nb的稳定性。此外，在不存在额外二硫键的情况下，部分NbCDR3由于序列过长将具有更高的灵活性，但是会导致Nb结构的构象稳定性有所降低。因此，CDR3序列对Nb稳定性的影响至关重要，同时依赖额外二硫键的限制。

　　3.2二硫键与Nb稳定性的关系

　　       通过对比Abs与Nb的结构可知，大部分骆驼VHH序列是通过二硫键来约束长序列环从而解决由于CDR3区扩展可能引起的稳定性问题。Nb中的二硫键类型分为保守和额外二硫键。几乎所有的VHH序列含有保守二硫键，而额外二硫键仅部分Nb含有，且其位置与数量各不相同，主要取决于半胱氨酸的数量及位置。研究表明，许多骆驼的VHH序列在CDR1区和CDR3区中均包含一对额外的半胱氨酸（Cysteine，Cys）残基，它们会形成环间二硫键。单峰骆驼的VHH序列中的环间二硫键主要在CDR1区和CDR3区之间形成，而部分单峰骆驼的VHH序列则在CDR3区和CDR2区之间形成环间二硫键。此外，研究发现在少量（约10％）的VHH序列中，CDR3区与FR255或FR2 50位之间含有二硫键。图6（b）显示的是VHH序列中发现到的3种不同类型的二硫键。由此可知二硫键的存在与半胱氨酸的位置及数量密切相关。半胱氨酸在FR2、CDR1和CDR2区域中的位置相对保守，几乎不发生显著变化，而CDR3区域中的半胱氨酸几乎出现在所有可能的位置，可能在N端、C端以及循环的中间位置，具体位置相对多变，不易预测。而对于半胱氨酸的数量来说，二硫键紧紧依赖于半胱氨酸的存在，研究人员对Abs及Nb中的半胱氨酸分别进行观察计数（表1）。

　　       在Abs可变区VH-VL中，半胱氨酸取代的现象非常稀少。由表1可知，在研究者提供的100个样品中，Abs可变区不含半胱氨酸的比例达80%左右，而Nb恰恰相反，含有半胱氨酸的抗体比例达80%，其中半胱氨酸位于CDR1区和CDR3区之间的抗体共占64%。由此可知，在Nb中，半胱氨酸的取代现象较为普遍，进而出现额外二硫键的概率相对较大，稳定性也会随之提高。

　　       研究表明，大部分羊驼VHH-CDR3序列相对较短，没有额外的二硫键，而少数羊驼CDR3序列相对较长，则存在额外二硫键，主要为B型额外二硫键（图6b）；而单峰驼出现的额外二硫键较多，主要为A型额外二硫键（图6b），少数单峰驼VHH的二硫键则出现在Cys55和CDR3之间，这些额外二硫键的作用主要是约束增大的CDR环，限制其构象迁移，稳定CDR3结构域并防止热诱导聚集，最终提高VHH的稳定性。因此，二硫键对于维持或增强Nb的稳定性具有极为重要的作用。

　　       虽然蛋白质的稳定性和可逆性在较大程度上取决于环境条件（例如pH、缓冲液、盐和蛋白质浓度），但VHH自身因含有二硫键而热稳定性较高，这也是基于二硫键不易断裂的特点。

　　4 结 语

　　       近年来关于Nb的相关研究为从微观层面认识Nb的优良结构基础提供了理论依据。通过对Nb进行结构表征，可指导Nb定向改造，有望在小分子生物领域及基因工程方面进行更深层次的应用。对于Nb结构与性质之间的关系，目前仍存在着诸多尚未解决的问题，如骆驼科的每一种亚型及其功能仍缺乏更全面系统的阐述；而对于V-D-J具体重排机制尚有待进一步研究；此外，VHH中的IGHM基因是何时且如何切换为IGHG系列基因的尚不得知；Nb中高变区域的突变氨基酸的数量和位置难以预测，尤其是CDR3区域，这也间接导致研究人员对突变氨基酸难以有一个较为全面且统一的认识。

　　       未来仍需深入研究影响Nb稳定性及抗原结合活性的因素；利用更加精细的结构研究手段如X-射线衍射、冷冻电镜等更准确的判断关键氨基酸和相互作用力，进而引导抗体的进化改造、随机突变或定点突变；或根据结构特点及高变区域构建多聚体以获得亲和力更高或特异性、灵敏度更强的Nb，这将是今后在Nb基础研究领域的重要方向。

　　       此外，虽说Nb较Abs更具独特优势，但同时也具有一定的局限性。首先，用于开发Nb的重链抗体只能从骆驼或鲨鱼中获取，而传统的单克隆抗体从小鼠体内便可获得；其次，目前已报道的生产Nb的方法在抗体产量、亲和性和降低生产成本方面依然具有较大的改进空间；此外，目前Nb在诊断与治疗方面的应用更具突出优势，而在小分子检测领域的潜在价值仍有待进一步开发。因此，克服这些局限性、促进Nb大批量低成本生产以及使其在小分子检测领域得到更广泛的应用也将成为后续研究的重要方向之一。