免疫组化 & 进一步查明原发性肿瘤的起源

　　免疫组织化学（IHC）是一种强大的基于显微镜的技术，用于可视化组织样本中的细胞成分，例如蛋白质或其他大分子。IHC的优势时直观的视觉输出，可揭示复杂组织中不同细胞类型，生物学状态和/或亚细胞定位情况下靶蛋白的存在和定位。

　　IHC技术是在1940年代发明的（Coons，Creech和Jones，1941年），通常用作医疗保健和病理学中的重要工具，例如用于诊断目的或对患者进行分层以优化治疗方案。IHC还广泛用于研究中，对感兴趣的分子进行分析以在分子，细胞或组织水平上研究其在健康和患病的细胞和组织中的作用。使用IHC或基于IHC的方法有多种执行组织中靶标可视化的方法，并且存在用于不同应用和测定的众多协议。尽管IHC通常是一种可靠且成熟的方法，但根据组织或靶蛋白，结合剂分子和/或报告系统的性质，通常需要对新的测定进行仔细的优化。多年的技术发展和对特定结合分子的大量增加极大地提高了IHC的实用性和应用领域。基于IHC的技术和试剂领域的进步使科学家和卫生保健提供者有了更精确的工具，测定法和生物标记物。此外，技术进步还使得能够同时检测同一样品中的多种蛋白质，以及检测蛋白质之间的相互作用 。

　　经典的IHC分析如图1所示，涉及使用能够以高特异性结合那些表位的“一抗”检测组织样品中单个蛋白质靶标表达的表位。在表位-抗体结合事件之后，添加能够以高特异性结合第一抗体的“第二抗体”。二抗偶联至报告分子，在抗体-抗体结合事件后，添加化学底物，该化学底物与报告分子反应，在整个表位-抗体复合物的位点产生有色沉淀。

　　

　　图1.免疫组织化学的基本原理

　　在示意图（图1）中，使用针对特定蛋白质靶标的一抗对福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片进行染色。将包含一抗的溶液添加到组织切片中，并让抗体有一段时间找到并结合其靶标。在该步骤之后，将未结合的抗体和多余的抗体洗掉，并添加第二抗体。携带带有辣根过氧化物酶（HRP）酶的连接子分子的第二抗体也需要一段时间与第一抗体结合，然后进行另一个洗涤步骤。之后，加入3，3'二氨基联苯胺（DAB）。HRP酶将DAB底物转化为褐色沉淀物，该沉淀物在反应部位沉积在组织中，

　　技术

　　组织准备

　　组织在实验中起着核心作用，对它进行加工以保留表位和适当的形态非常重要。IHC最常见的处理方法是制备福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块。福尔马林固定的目的是在组织内产生蛋白质的化学交联。这终止了所有细胞过程，并使细胞成分在固定时的位置和构象中冻结，并防止降解。充分固定后，将组织进一步处理并最终包埋在石蜡块中，然后使用切片机将其切成薄片（通常为4-10μm）。将这些部分转移到载玻片上，并在进一步处理之前粘附。

　　有时使用除福尔马林之外的其他固定方法。这些包括其他类型的醛或使用不同的醇溶液。固定剂的最佳选择在很大程度上取决于测定。FFPE的常见替代方法是制备冷冻组织样品。在这种情况下，将组织包埋在冷冻保护介质中并冷冻，并在切片后进行固定。将冷冻的组织切成低温恒温器，具有加工时间短和敏感表位得到更好保存的优势，但是在保存组织学形态方面通常不如FFPE组织。

　　抗原（表位）检索

　　与诸如福尔马林的交联固定剂或在固定剂中花费的时间过长有关的一个问题是表位的掩盖，这会阻碍一抗与其靶标结合。尤其是对于FFPE样品，通常需要先进行一些化学交联并“检索”表位，然后再进行实际的IHC。有几种可用的抗原回收方案，主要策略包括用加热，消化酶，去污剂或其组合处理组织玻片。FFPE样品中最常见的抗原回收方法是在酸性柠檬酸盐缓冲液中将组织玻片加压煮沸约15-20分钟。

　　抗体结合

　　结合分子的质量和特异性对于任何基于IHC的技术都是至关重要的，结合剂的选择会直接影响结果，可靠性以及可能的分析解释。迄今为止，抗体是用于IHC的最常见的结合分子类型，尽管大多数抗体都能充分检测到正确的目标分子，但它们对预期靶标的特异性也可能有很大差异。因此，具有高特异性的抗体在解释“靶标”结合时更可靠，因为它们几乎不产生或不产生“靶标”结合或“背景”。特异性较低的抗体可产生更多的脱靶结合，并且产生的背景可能会干扰对真正的靶信号的正确解释。抗体有两种主要类型：多克隆抗体是结合靶标上不同表位的抗体和均结合相同表位的单克隆抗体的异质混合物。多克隆抗体由于能够检测并结合同一靶标上的多个表位，因此通常非常有效。但是，它们结合的表位通常定义不清，并且具有多种多样的表位特异性，使脱靶结合事件和背景噪声的可能性增加。然而，多克隆抗体的效力可能是有利的，因为在靶分子周围的结合事件的浓度通常超过潜在的背景噪声。缺点是多克隆抗体通常是有限的资源，因为它们源自动物血清。相比之下，单克隆抗体 具有连续性，因为它们可以在杂交瘤细胞系中产生。单克隆抗体通常在表位结合方面也有很好的定义，但是如果特异性低或目标表位丰度低，仍然可以产生难以解释的结果。

　　对于每种测定，都需要仔细优化和滴定抗体浓度，因为结果不仅取决于抗体对靶标的特异性和亲和力，还取决于靶标中存在的靶标和潜在脱靶表位的浓度和可用性。样品。一旦靶上表位被粘合剂饱和，向样品中添加太多抗体将增加可能的低亲和性脱靶结合事件的数量。通过降低抗体浓度，脱靶结合事件变得罕见，因为它们通常比脱靶结合事件具有更低的亲和力。在尝试使用低亲和力抗体降低背景时的风险是，伴随作用的目标信号会同时减弱到提供假阴性结果的程度。

　　有时在基于IHC的技术中使用的其他类型的粘合剂分子包括亲和体，肽，抗体片段或其他小分子。

　　检测系统

　　进行IHC的整个目的是获得在实验组织中可以找到靶标的位置的可视表示，并且最好还获得有关异源细胞群和/或亚细胞定位中靶标表达模式的信息。这在图2中得到了示例，该图说明了如何使用不同的抗体来可视化复杂组织中的不同细胞或组织区室。为了使靶标-抗体相互作用可视化，需要产生可观察到的污渍或信号的某种检测系统。将检测系统引入实验的最常见方法是使用带有预先结合的报告分子的二抗，即酶或荧光团。二抗通常通常针对不同动物物种的抗体分子。例如，如果一抗是在兔中产生的，那么二抗必须在另一只动物中被产生，并且特异性地针对兔抗体。

　　

　　图2.可视化复杂组织中的不同蛋白质靶标。右列显示左列中相应图像的放大倍数。

　　在IHC图像（图2）中，使用四种不同抗体对人食道进行连续染色后，可以直接比较组织内和亚细胞区室中不同蛋白质的表达模式。顶部图像仅对苏木精复染色以进行比较。p63抗体对位于食道上皮基底部分的细胞群中的细胞核染色。EGFR（表皮生长因子受体）抗体似乎可以染色与p63相同的细胞群，但是可以染色细胞膜而不是细胞核。G6PD（6-磷酸葡萄糖脱氢酶）抗体可对食管上皮细胞以及结缔组织中的细胞组成的细胞谱进行染色。

　　对于FFPE组织样品，最常见的检测方法是使用酶促反应在抗体结合位点产生有色沉淀。然后，二抗携带一种酶，例如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP），它们能够转化发色团，例如3,3'二氨基联苯胺（DAB）或5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸/对硝基蓝氯化四氮唑（BCIP / NBT）呈棕色或蓝色沉淀，在反应部位沉积在组织中。显色性染色在光学显微镜下可观察到，并且通常在很长一段时间内非常稳定，如果需要在以后的某个时间点对实验进行存档或检查，则非常有益。

　　对于冷冻的组织切片，更常见的是使用荧光团连接的二抗，当被正确波长的光激发时，该二抗会发出特定的颜色（通常是绿色，红色或蓝色）。此外，荧光团通常长时间不稳定。但是，使用荧光团的好处是，它们提供了一种简便的方法来执行双标记实验，该实验中在同一样品中测定了针对多个靶标的几种抗体。二抗需要针对不同的一抗，也必须与不同的荧光团偶联。然后通过用不同波长的光顺序激发它们来分别观察不同的二抗。

　　使用携带报告基因的二抗进行检测本身就是一个扩增步骤，因为几种二抗能够结合单个一抗，但是有时需要进一步的扩增步骤以增加实验的信号和灵敏度。在这样的情况下，第二抗体可以替代地携带“接头分子”，例如生物素聚合物，其能够在后续步骤中募集更多的报告分子。这种放大信号的策略对于酶和荧光检测方法都是有用的。

　　复染

　　使用发色团的免疫组织化学染色通常受益于使用复染剂，该复染色剂可增强对比度并促进组织学特征的观察。用于FFPE样品的最常见复染类型是苏木精，苏木精将细胞质染色为淡蓝色，将细胞核染色为深蓝色。由于检测方法不是基于光学显微镜，因此通常不使用苏木精对荧光染色进行染色。取而代之的是，获得荧光复染的最常见方法是通过添加结合核酸的荧光染料标记细胞核。在实际的免疫组织化学反应之后，剩下的唯一步骤是盖玻片并密封样品以进行保护和长期保存。最常见的方法是“粘”

　　具体例子

　　IHC在研究和临床实践中被广泛使用。人类蛋白质图谱（HPA）项目是如何使用高通量IHC在众多组织，癌症和细胞中实现人类蛋白质组的大规模作图的主要示例。在HPA项目中，简化的内部大规模抗体生产链促进了特异性抗体的产生，在通过基本表征和验证方案后，该抗体可用于在单个实验中对包含数百个组织核心的组织微阵列进行系统染色。HPA所使用的IHC系统在很大程度上依赖于协议的标准化和使用机器的自动化，但是在批准将抗体染色在整个组织上之前，人工对每种抗体的最佳滴定进行评估。

　　在临床实践中，IHC主要用于病理学中，以帮助医生评估与健康和/或疾病状态相关的组织标本，进行诊断并定义不同类型癌症的分子亚型。在诊断中使用IHC的一个具体例子是当病理学家出现转移性肿瘤样品而原发性肿瘤的组织起源未知时。在这些情况下，病理学家使用一系列针对组织特异性蛋白的不同抗体，例如针对前列腺癌的前列腺特异性抗原，针对妇科癌症的雌激素受体或针对胃肠道癌症的细胞角蛋白20（Gremel et al。，2014）。一旦进行了广泛的分类，将使用其他组织特异性抗体来进一步查明原发性肿瘤的起源。

　　

　　食管

　　HPA001200

　　男性，62岁

　　食道（T-62000）

　　胃（T-63000）

　　腺癌，NOS（M-81403）

　　正常组织，NOS（M-00100）

　　患者ID：2105

　　鳞状上皮细胞

　　染色：没有检测到

　　强度：负

　　数量：没有

　　位置：没有

　　

　　食管

　　HPA018530

　　女性，61岁

　　食道（T-62000）

　　正常组织，NOS（M-00100）

　　患者ID：1924

　　鳞状上皮组织

　　染色：高

　　强度：强大

　　数量：75%—25%

　　位置：细胞质/细胞膜

　　

　　食管

　　CAB073534

　　女性，81岁

　　食道（T-62000）

　　正常组织，NOS（M-00100）

　　患者ID：2574

　　鳞状上皮组织

　　染色：介质

　　强度：中等

　　数量：75%—25%

　　位置：细胞质/细胞膜