流式细胞那些事(二)

　　20世纪60年代后期流式细胞术开始得到广泛应用，通过流式细胞仪可以快速的定量分析细胞群的物理化学特征，同时可以根据这些物理化学特征对铣刀进行精确分选。今天就来简单的介绍一下流式细胞术。

　　流式细胞仪

　　首先我们简单的了解一下流式细胞仪，市面上的流式细胞仪型号有许多种，但其基本结构都是相同的，分析性流式细胞仪几乎都是由液流系统、光路系统、检测分析系统组成。

　　1.液流系统

　　

　　2.光路系统

　　光路系统始于激光器，其分类方法繁多，最常见的分类方法是根据其发射的激光的波长来分，常见的有蓝激光器488nm、红激光器635nm和紫激光器405nm，不同的激光器发出的激光照射到细胞后产生的光信号会经过不同的光路系统被不同的通道接收。

　　流式细胞仪采集的光信号包括散射光信号和荧光信号，散射光信号也就是我们常说的FSC（前向散射光，反应细胞的大小）、SSC（侧向散射光，反应细胞的复杂程度）；荧光信号是细胞上结合有荧光素，被激光激发以后，会发射荧光信号。

　　

　　3.检测分析系统

　　检测分析系统就是以通道为单位将细胞的各个通道的光信号汇总分析，最后得出样品群体中细胞的物理化学特征。其中通道（光电倍增管）有2个作用：

　　①将光信号转变为电子信号；

　　②放大电子信号。可以分为散射光通道（FSC通道、SSC通道）和荧光通道，一个激光器下可以有多个荧光通道，一个通道对应多个荧光染料。

　　样品细胞检测流程

　　流式细胞术检测的对象一般是呈独立状态的悬浮于液体中的细胞，如果要检测组织中的细胞，则必须先将组织制备成单细胞悬液，而后方可进行检测。

　　制备基本流程如下：

　　1.细胞的培养、制备

　　将一定数量的单个细胞收集于1.5mL的EP管中，2400rpm、4℃离心4min，弃上清；加入1xPBS清洗，同等条件进行离心，弃上清。

　　2.封闭

　　用来标记样品细胞的荧光素偶联抗体多为单克隆抗体，少数也可能是多克隆抗体，但其基本结构都是由两部分组成：包含有特异性结合抗原位点的Fab段、相对保守的Fc段。抗体的特异性表现在Fab段，标记时利用Fab段的抗原结合位点与细胞上抗原分子进行特异性结合，从而进行标记并且相对量化的展示了细胞表达该抗原分子的情况。

　　3.荧光素偶联抗体标记

　　以CD3-APC-Cy7、CD4-FITC为例，一般染色体系推荐100μl，CD3、CD4表达量相对较高，1μl足够了，假如有9个样本，分别取10μlCD3-APC-cy7、CD4-FITC加到含有990μl的1.5ml的EP管中，混匀后，分别取100μl加到9个样品孔中，混匀，室温、避光染色20min。时间到后加1ml FACS buffer洗去未结合的抗体，2400rpm、4°C离心4min，弃上清，加200μl FACS buffer或2%的多聚甲醛重悬沉淀，并尽快上机分析。

　　

　　4.光电倍增管电压的设定

　　上机分析时，在确认机器没有问题后，需调节每个通道的光电倍增管的电压，从而区分细胞群，利用FSC和SSC，通过调节FSC和SSC的电压，区分淋巴细胞亚群，使样品细胞或者目标细胞位于流式图的中央或者靠近中央的位置。FSC和SSC的电压确定之后还需调节APC-cy7、FITC的电压，使阳性细胞群和阴性细胞群尽可能的分离。

　　5.设置对照，补偿调节

　　流式实验中对照设置很重要，常见的有阴性对照、FMO对照、补偿单阳管对照。

　　实验注意事项

　　1. 因实验需保证待检测样品细胞为单细胞悬液，因此在细胞培养、制备阶段，贴壁细胞需用先用胰酶消化成单个细胞，而后再后收集待测样品细胞；胸腺、脾脏和淋巴结等外周免疫器官，主要由免疫细胞组成，只需直接将脏器经钢网研磨即可制成单细胞悬液；实体脏器肺脏、肝脏和肿瘤组织内含有较多的结缔组织，而实体脏器细胞之间一般结合紧密，所以直接简单的将脏器进行研磨是无法得到理想的单细胞悬液的，因此，研磨前需将脏器剪碎后加入IV型胶原酶和DNA核酸内切酶消化，而后再将消化后的组织用研磨棒直接研磨，从而得到理想的单细胞悬液（实体脏器研磨后的单细胞悬液以实体细胞为主，如果研究目标不是实体细胞，而是脏器内浸润的免疫细胞，可以用Percoll密度梯度离心法富集免疫细胞）。而后对收集到的理想的单细胞悬液进行离心、洗涤、封闭、标记荧光素偶联抗体后，即可进行流式分析。

　　

　　2. 调节电压时，如果检测的目标细胞体积较小，可以适当提高电压值，使目标细胞与细胞碎片在流式图中能够完全分离；如果检测的目标细胞体积较大，可以适当降低电压值，使所有的目标细胞群完整显示于流式图中，防止细胞群接近于流式图的边界而变形扭曲或者完全处于边界外。

　　3. 关于样本的封闭，并不是标记荧光素偶联抗体之前必须封闭样品，一般样品细胞与流式抗体的种属来源是不同的，如标记人的细胞的荧光素偶联抗体一般来源于小鼠，人细胞的FcR也不一定能够与小鼠来源的荧光素偶联抗体的Fc段结合，但是，也有可能因为种属关系较近，或者在一定环境条件下这种不同种属间的Fc段和FcR也能结合，实验者很难判断实验过程中这种结合是否会发生，但是在标记荧光素偶联抗体前封闭样品却可以保证这种非特异性结合一定不会发生。所以，当条件允许时，实验者最好选择对实验样品进行封闭处理。

　　

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