Nature：PROTAC之外，PROTAB的新机遇！

　　

　　引言

　　大多数的小分子靶向药都是通过拮抗配体结合或激酶活力发挥抑制作用的。这种小分子抑制剂往往只可以抑制膜蛋白的某一结构域，而并不能抑制整个蛋白质分子的功能，有很大治疗局限性。如此而来，科学家们认为靶标降解是优于靶标抑制的药物设计方案，因此靶向蛋白质水解的技术应运而生。 近些年，PROTAC的发展迅速，俨然已经成为最具潜力的肿瘤靶向疗法之一。而关于优化PROTAC技术路线，提高口服利用度，药物渗透性以及改善药动学、药效学性能的研究正如火如荼地展开。

　　作者 | 徐莉莎

　　

　　12月21日， 阿泰克科学创始人、复旦大学生命科学学院教授丁澦

　　最近，Nature发表了来自基因泰克的科学家们成功构建的蛋白水解靶向抗体(PROTABs)平台，经过验证发现该技术在体内体外均可使靶点高效降解并具有组织选择性。具体发现如下：1）证实PROTAB可参与蛋白酶体和溶酶体两种途径的降解。2）鉴定出了一系列可用的膜连E3泛素化连接酶。3）拓展了PROTAB可降解靶点。4）探究通过何种设计抗体的形式优化靶蛋白清除率。

　　PROTAB的结构

　　PROTAB是一个双特异性抗体，两条抗体臂一端靶向E3连接酶N端糖蛋白D（gD）表位，另一端靶向为靶蛋白。（类比于PROTAC分子具有两个共价连接配体可以同时募集E3泛素化连接酶和靶蛋白）

　　

　　图注：PROTAB的结构

　　E3连接酶靶标：本文选择“环指蛋白43（RNF43）和锌环蛋白3（ZNRF3）”，这两种蛋白作为Wnt信号通路的下游蛋白可下调Wnt信号，并凭此调节成人干细胞的Wnt活性。在正常的肠组织中，RNF43和ZNRF3的表达被限制于肠隐窝的底部（干细胞栖息地），而结直肠癌中Wnt信号的高度活化会导致RNF43和ZNFR3的表达突破正常组织的限制。

　　靶蛋白：本文聚焦“胰岛素生长因子1受体（IGF1R）”。IGF1R是一种在不同组织和癌症中介导生长因子信号的受体酪氨酸激酶。目前针对IGF1R的单克隆抗体已经上市，故研究人员选择了七种已得到证实的IGF1R单克隆抗体（西妥木单抗等）作为抗体臂的另外一端。

　　RNF43和ZNRF3降解IGF1R的功能验证

　　研究人员通过IP实验，确定了RNF43/ZNRF3与IGF1R之间存在相互作用。不仅如此，对于表达gD-RNF43-Flag或者gD-ZNRF3-Flag的细胞，该种PROTAB分子的加入可以诱导细胞表面IGF1R的清除和降解，即连接酶-靶蛋白二聚体可以介导靶蛋白的降解。

　　

　　图注：表达gD-RNF43-Flag细胞PROTAB治疗后IGF1R清除水平

　　但研究人员发现，IGF1R抗体与IGF1R的亲和力并不能完全预测细胞表面靶蛋白的清除情况，抗原结合表位和PROTAB三元结构的几何构造也可能是决定性的影响因素。

　　联系到实际治疗情况当中，研究人员又将该原理推及到内源性的连接酶上。他们设计了Cixu*gD PROTAB分子(一种拥有西妥木单抗和gD识别臂的PROTAB分子)，其中gD识别臂的选择是基于筛选出的40种抗ZNFR3抗体和65种抗RNF43抗体。该研究也证实了PROTABs可以通过内源性E3连接酶驱使IGF1R降解。

　　ZNRF3*IFF1R PROTABs的特征性描述

　　经过前期的概念验证，研究者们已确定PROTABs的基本功能。那么IGF1R PROTABs到底有什么特征那？

　　首先，相对于单用西妥木单抗，PROTABs可以更大程度抑制IGF驱使的AKT和S6磷酸化，下调IGF下游信号通路，抑制癌细胞生长。

　　

　　图注：PROTABs对于IGF下游信号通路的影响

　　第二，PROTABs的生物利用度也得到了评估，1mg/kg的PROTABs就可使荷瘤小鼠的IGF1R大量降解，并且与某些PROTACs一样有钩状效应的出现。 最后，无论是在小鼠和人类结肠类器官上，PROTABs的降解作用都有选择性。它往往只会有效降解肿瘤细胞上的IGF1R，而不会影响正常组织上的IGF1R，这与西妥木单抗无差别的攻击形成了鲜明的对比。

　　 图5：PROTABs对于肿瘤组织的选择性 

　　ZNRF3*IGF1R发挥作用的潜在机制

　　首先，研究者人员对于IGF1R和ZNRF3进行拷贝数分析，发现在IGF1R/ZNRF3普遍大于400的情况下，IGF1R仍然可以显著清除，这说明不同于小分子药物的活性是由靶标的占据驱动的，PROTABs则可以充当催化剂对靶蛋白进行重复降解。 第二，PROTABs发挥活性的最适条件依赖于ZNRF3的环状和C端结构域。 第三，PROTABs通过连接ZNRF3和IGF1R诱发ZNRFs介导的IGF1R泛素化。

　　

　　图注：IP试验反映ZNRF3和RNF43介导的IGF1R泛素化 第四，PROTABs诱导的IGF1R降解是通过蛋白酶体和溶酶体双途径实现的。

　　

　　图注：分别抑制蛋白酶体降解途径和溶酶体降解途径对IGF1R清除的影响 

　　拓宽PROTAB靶标的尝试

　　为使研究结果具有普适性，科学家们将目光聚焦于建立通用型PROTABs平台之上。靶向HER2和PD-L1的PROTABs均获得了不错的成效，这意味着PROTABs靶向多种治疗相关表面蛋白的可能性。 

　　PROTAB平台的优化

　　最后，研究人员想知道可否通过PROTAB的分子设计提高靶标清除效率，为此科学家们设计出了四种结构的PROTABs,并探究不同的结构对于靶标清除效率的影响。结构设计如下图：

　　

　　图注：四种抗体结构

　　研究表明，与标准的双特异性抗体相比，2（target）+1(ligase) Fab-IgGs所造成的IGF1R清除变化不大；2（ligase） +1(target) Fab-IgGs可以显著提高IGF1R清除率；单臂的IGF1R-RNF43Fv-IgG也可以显著提高IGF1R的清除率，而两抗体位置反转之后却因为PROTAB与IGF1R亲和力的降低无法达到提高清除率的效果。因此抗体亲和力，分子形式和抗原表位的优化是提高靶标降解效率的关键点。

　　

　　

　　图注:三种优化PROTAB结构对于IGF1R清除效率的影响

　　总结

　　本文中所阐述的PROTAB分子可以在体内体外高效消除靶蛋白分子，所采用的技术路线也可以说是PROTAC技术的变体。 相比于传统的小分子靶向药物，PROTAB与PROTAC一样具有如下几点优势： 

　　1）PROTAB作为催化剂可以重复启动靶蛋白的降解事件，这与小分子药物靶标占据的驱动相比，所需的治疗药物，给药品率和毒性明显降低； 

　　2）PROTAB是清除靶标，这显然优于小分子药物受到靶标结构限制的抑制功能； 

　　3）对于某些小分子药物“不可成药”的靶点（缺乏变构或正构位点），PROTAB依旧可以发挥其降解作用。 

　　就降解方式来说，PROTAB所诱导的降解是一种蛋白酶体和溶酶体双途径的降解，这种“双保险”无疑进一步佐证了其疗效的优越性。不仅如此，相比于针对靶标的抗体，PROTAB具有更好的组织选择性，这支撑了PROTAB成为了一种对机体影响较小的治疗方式。 尽管PROTAB平台的治疗潜力还有待发掘和完善，但此技术与模块化抗体技术的结合有望成为影响膜受体功能的新机遇。无论是在基础研究和临床治疗，PROTAB都具有惊人的价值，也将迸发出强大的生命力。

　　参考文献

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