京都大学团队揭示用于筛选功能性纳米抗体酵母表面展示系统评价

　　酵母表面展示是一项强大的技术，用于分离和改造蛋白质以提高其活性、特异性和稳定性。在该方法中，基因表达受启动子调控，分泌效率受分泌信号影响。此外，所展示蛋白质的可及性和活性都受到锚定蛋白长度的影响。理想的启动子、分泌信号和锚定蛋白组合取决于感兴趣的蛋白质。

　　在这项研究中，我们优化了适合纳米抗体评估的酵母表面展示。我们设计了五个展示系统，它们使用启动子、分泌信号和锚定蛋白的不同组合。抗鸡蛋清溶菌酶纳米抗体用作模型纳米抗体。酵母细胞上展示的纳米抗体的数量，对与展示的纳米抗体结合的抗原数量和展示效率进行了量化。总体而言，我们改进了用于纳米抗体工程的酵母展示系统并提出了优化建议。

　　使用五个显示系统的纳米抗体的细胞表面显示

　　为了确认细胞表面上的纳米抗体生产，酵母细胞针对表位标签进行染色，并通过荧光显微镜观察（图 1）。展示抗鸡蛋清溶菌酶纳米抗体的酵母细胞被抗 HA 标签抗体成功染色。此外，对照菌株成功地标记有抗 FLAG 标签抗体，而不是抗 HA 标签抗体。这些结果表明所有五种设计的质粒（表 1）均可用于纳米抗体展示。

　　图1 酵母细胞的免疫荧光标记

　　评估启动子、分泌信号和锚定蛋白的作用

　　为了评估启动子、分泌信号和锚定蛋白的影响，在五个展示系统中比较了酵母细胞上展示的纳米抗体的数量和 Q2 区域中酵母细胞的比例。五种显示系统Q2区酵母细胞比例如图 3a所示，AF488和AF647的相对荧光强度如图3b所示 。在所有系统中，AF647 在 30 °C 时的荧光强度高于 25 °C 时的荧光强度，表明纳米抗体在前一个温度下更具活性。这些数据在图 1 和 2 中针对每个参数进行了更详细的分析。

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　　比较了系统1和2中分泌信号的影响（图 4）。系统 2 中 AF647 的归一化荧光强度高于系统 1，表明与葡糖淀粉酶分泌信号相比，改进的 α 因子分泌信号增加了展示的功能性纳米抗体的数量。

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　　还比较了系统2和3以及系统4和5中锚蛋白的作用（图 5）。对于 649-stalk，与 α-凝集素相比，与溶菌酶结合的纳米抗体数量增加了约 1.5 倍。这可能是因为纳米抗体被展示得离酵母表面更远，并且纳米抗体对抗原的可及性得到改善。

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　　最后比较了系统2、4和系统3、5中启动子的作用（图 6）AF488 和 AF647 的荧光强度在GAP启动子下比在GAL1启动子下更高（图 6 a、b [左图和中图]）。这些数据表明GAP启动子比GAL1启动子强；然而，在GAL1启动子下，Q2 区域中酵母细胞的比例高于在GAP启动子下（图 6 a、b [右图]）。

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　　总之，本研究检查了有关纳米抗体酵母表面展示的各种关键参数。在考虑评估纳米体文库制备的条件时，有两点很重要：第一，酵母产生正确折叠的纳米体的比例应该很高，第二，每个突变体的结合能力应该被精细评估。这里，在GAL1启动子下展示效率高，并且在GAL1启动子下展示的纳米抗体的量小于在GAP启动子下的纳米抗体（图 6）。因此，预计在GAL1下亲合力效应会降低发起人。因此，我们可以评估亲和力，即展示的纳米抗体与其抗原的单次相互作用的强度。此外，我们证实了使用αpre-pro信号提高了纳米抗体的抗原结合能力（图 4），并且通过长锚定蛋白提高了可及性（图 5）。总的来说，在这项研究中获得的知识将使我们能够在未来评估纳米抗体的制备。

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