猪传染性胃肠炎病毒抗体（TGEV）ELISA试剂盒使用说明书

　　猪传染性胃肠炎病毒抗体（TGEV）ELISA试剂盒使用说明书

　　本试剂仅供研究使用       目的：本试剂盒用于测定猪血清，血浆及相关液体样本中传染性胃肠炎病毒抗体（TGEV）含量。

　　实验原理：

　　    本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中猪传染性胃肠炎病毒抗体（TGEV）水平。用纯化的猪传染性胃肠炎病毒抗体（TGEV）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入传染性胃肠炎病毒抗体（TGEV），再与HRP标记的传染性胃肠炎病毒抗体（TGEV）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的猪传染性胃肠炎病毒抗体（TGEV）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中猪传染性胃肠炎病毒抗体（TGEV）浓度。

　　试剂盒组成：

　　试剂盒组成

　　      48孔配置

　　96孔配置

　　保存

　　说明书

　　1份

　　1份

　　 

　　封板膜

　　2片（48）

　　2片（96）

　　 

　　密封袋

　　1个

　　1个

　　 

　　酶标包被板

　　1×48

　　1×96

　　2-8℃保存

　　标准品：180U/L

　　0.5ml×1瓶

　　0.5ml×1瓶

　　2-8℃保存

　　标准品稀释液

　　1.5ml×1瓶

　　1.5ml×1瓶

　　2-8℃保存

　　酶标试剂

　　3 ml×1瓶

　　6 ml×1瓶

　　2-8℃保存

　　样品稀释液

　　3 ml×1瓶

　　6 ml×1瓶

　　2-8℃保存

　　显色剂A液

　　3 ml×1瓶

　　6 ml×1瓶

　　2-8℃保存

　　显色剂B液

　　3 ml×1瓶

　　6 ml×1瓶

　　2-8℃保存

　　终止液

　　3ml×1瓶

　　6ml×1瓶

　　2-8℃保存

　　浓缩洗涤液

　　（20ml×20倍）×1瓶

　　（20ml×30倍）×1瓶

　　2-8℃保存

　　 

　　样本处理及要求：

　　1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

　　2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA、者柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

　　3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

　　4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

　　5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

　　操作步骤

　　1.         标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为120U/L，80U/L ，40U/L，20U/L，10U/L）。

　　2.         加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

　　3.         温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

　　4.         配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

　　5.         洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

　　6.         加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

　　7.         温育：操作同3。

　　8.         洗涤：操作同5。

　　9.         显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

　　10.     终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

　　11.     测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

　　注意事项：

　　1．  试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

　　2．  浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

　　3．  各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

　　4．  请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。

　　5．  封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

　　6．  底物请避光保存。

　　7．  严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

　　8．  所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

　　9．  本试剂不同批号组分不得混用。

　　10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。

　　计算：

　　以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，   

　　在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD     

　　值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释      

　　倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标      

　　准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值      

　　代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释      

　　倍数，即为样品的实际浓度。                  

　　试剂盒性能：

　　 

　　1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。

　　2.批内与批见应分别小于9%和11%

　　检测范围：                                              

　　6U/L -160U/L

　　保存条件及有效期：

　　1.试剂盒保存：；2-8℃。

　　2．有效期：6个月