小尺寸药物偶联会成为治疗实体瘤的替代方案么？

　　前言

　　ADC迭代更新，已经历三代技术革新，目前的技术主要集中在大型全免疫球蛋白形式，以DAR为2或4为主，第三代ADC的DAR达到了7。考虑到希望ADC在实体瘤中能有重大突破，研究者们开始探索具有更好穿透特性和更快药代动力学(PK)的小尺寸药物偶联形式，希望获得更宽的治疗窗口。这里综述了近十年在该领域的发展概况，小尺寸药物偶联跨越了从80KDa到1KDa，研发结果是否如愿以偿呢？这里先给个结论：小尺寸药物偶联在体外验证时普遍是有效的，但在体内验证时发现，清除速度过快，导致效力曲线发生了变化。

　　作者 | NING

　　小尺寸药物偶联包括哪些形式

　　

　　图一：抗体片段（FDC）或支架-药物偶联的各种形式图示

　　（注：使用MMAE毒素按比例绘制蛋白质或肽格式；所示分子量是针对没有有效载荷的蛋白质）

　　小尺寸药物偶联的内化、肿瘤穿透问题

　　小尺寸药物偶联的内化摄取必须与肿瘤穿透性分开考虑。因为如果ADC不能进入并杀死肿瘤块的所有部分，即使总体吸收率很高，治疗效果也会很差。也许更糟糕的是，肿瘤边缘细胞毒性药物高浓度区域可能会促使耐药性，从而使治疗完全无效。 ADC的靶向给药包括4个主要步骤：血液流向肿瘤，穿过毛细血管壁(外渗)，通过组织扩散并在细胞表面结合/内化。而血流速度可能比外渗速度快100-1000倍，这意味着肿瘤血管周围边界的ADC浓度可能比血浆浓度低2-3个数量级。实体瘤内的高间质压力阻碍了局部对流，这意味着穿透肿瘤的主要运输方式是扩散。较小ADC的外渗和扩散速度更快，但清除率也更高，而IgG的长半衰期有助于为肿瘤提供更多的“绝对抗体”。

　　图二：小鼠亚饱和(A、B)和饱和(C、D)条件下特异性和非特异性 IgG(A、C)和 scFvs(B、D)的时间曲线

　　小尺寸药物偶联的副作用与亲和力问题

　　小尺寸药物偶联缺乏FC结构域，降低了与各种免疫细胞的Fc受体的交叉反应性，这种较低的整体血浆暴露率降低了毒素脱靶的可能性，可以帮助加宽整体治疗窗口。 高亲和力可能限制肿瘤对小尺寸药物偶联的吸收，而较低的亲和力有更均匀的渗透率。在一项研究中，10 pM亲和力抗HER2-scFv观察到在血管周围结合，而较低亲和力scFv的渗透性提高了4倍。

　　图三：亲和力限制了肿瘤对小片段ADC的吸收。四种ADC为靶向HER2的不同亲和力变体

　　抗体片段-药物偶联(FDC）

　　4.1    Fab-药物偶联   Fab片段包含IgG的恒定和可变结构域，通过存在于C端的单个二硫键连接。它们可以说是临床上探索最多的片段形式(~50KD)，并且非常适合通过双烷基化缀合进行药物缀合，因为它们具有单一的、溶剂可及的链间二硫键。研究表明，在Fab的链间二硫化物处的缀合具有高度选择性，制备出均质缀合物并且理想地位于结合域远端。因此，理论上预计药物对Fab的结合特性影响最小。还有在特定位置引入半胱氨酸残基的工程方法。

　　

　　图四：二硫键还原共价偶联制备稳定Fab-drug conjugates

　　一款靶向CD3分子的双特异Fab药物偶联物(P-SMAC)，其EC50约为100 pM，有效载荷是二羧丙基脲基戊二酸(DUPA)(一种对前列腺特异性膜抗原具有选择性的小分子配体)。有趣的是，缀合物的半衰期延长至未修饰Fab的1小时半衰期的约5倍，特别是与其他类似分子量的小型T细胞接合剂相比，产生了良好的PK曲线，这可能归因于疏水性增加。

　　图五：P-SMAC 具有预防功效

　　4.2   Diabody-药物偶联     Diabody是指双特异性抗体形式(~60KD，见图六)。众所周知：当RAS和P53发生突变后，它们的突变基因蛋白会被水解产生肽，这些肽段可以和人类白细胞抗原(HLA)蛋白形成复合物(pHLA)，然后被呈递在细胞表面，成为T细胞受体(TCR)可识别的新抗原。但一直以来RAS和P53靶点被认为不可成药。 2021年5月，约翰·霍普金斯大学Bert Vogelstein教授团队在《科学》及子刊《科学·免疫学》[6]上发布的最新研究成果显示：新型抗体Diabody可成功靶向RAS和P53突变，作用于RAS-HLA复合体或P53-HLA复合体能够显著抑制肿瘤的生长，完美的实现了真正的精准打击。

　　

　　图六：scDb（Diabody）的结构

　　

　　图七：scDb的体内抗肿瘤功效

　　4.3  SIP-药物偶联     小免疫蛋白(SIP)(~80KD)包含与Ig衍生恒定区融合的scFv片段。这些恒定区的存在促进了两种单体的非共价二聚化。与SIP的化学缀合通常通过将半胱氨酸残基位点特异性掺入单体的恒定结构域来实现。由于SIP通常在哺乳动物细胞中表达，因此可以很容易地改变诸如恒定结构域、接头长度和位点特异性氨基酸等特征。

　　

　　图八：SIP与IgG大小对比

　　4.4  SCFV-药物偶联  

　　ScFv由IgG重链和轻链的可变区组成，通过短氨基酸间隔区、二硫键和两者连接(~27KD)。scFv的小尺寸使其适合在细菌和酵母系统中表达。这也使它们成为细胞展示、噬菌体展示、酵母展示和核糖体展示等高通量选择技术的理想候选者。故可以针对目标蛋白筛选大型克隆文库。通过多轮筛选可以识别和表达针对疾病靶点的高结合克隆。使用定点诱变可以很容易地将反应性氨基酸引入片段上的特定位置，然后用于高度可控的有效负载缀合。

　　

　　图九：不同 scFv形式的示意图

　　有证据表明使用基于NHS酯接头的非特异性赖氨酸缀合是scFv修饰的可行选择。此外，传统和新型化学修饰、非天然氨基酸的掺入、酶促方法(如基于转谷氨酰胺酶的方法)以及多组氨酸标签、SNAP-标签的加入都可用于scFv缀合。例如，SNAP-tag技术允许将苄基鸟嘌呤修饰的细胞毒性有效载荷(如 AURIF)与scFv-SNAP融合蛋白进行位点特异性共价和不可逆偶联[5]。

　　 图十：SNAP-tag技术和scFv-SNAP-AURIF偶联物的作用机制

　　支架-药物偶联

　　(Scaffold–Drug Conjugates(SDCs))

　　支架往往比 6-21 kDa 的抗体片段更小，可以在大肠杆菌中表达，并且具有更高的稳定性。目前，大多数应用于成像和受体/配体抑制。最近对该领域的一项商业分析显示有 84 种独特的支架-药物偶联正在开发中，其中 82% 处于临床前/发现阶段，40% 用于肿瘤学。 5.1Affibody-药物偶联  Affibody是来自葡萄球菌蛋白A中的z结构域的小型三螺旋蛋白(~ 7kDa)。血清半衰期约20min，约20年发展史。Affibody在大肠杆菌中易于表达，可用于配体展示技术，如噬菌体展示和细胞展示。此外，支架的简单性使固相肽合成成为可能。通过在支架的耐受修饰区域位点特异性地修饰半胱氨酸残基可进行化学偶联。 Jacek Otlewski及其同事通过将MMAE与单体Z(HER2:4)(Z为一种Affibody)和二聚体Z(HER2:4)2结合构建了两种Affibody-药物偶联。实验表明，偶合物可将MMAE特异性递送至HER2阳性肿瘤细胞，最终导致其死亡。 图十一：用PBS、500 nM (Z HER2:4) 2 DCS 和 500 nM (Z HER2:4 ) 2 DCS-MMAE 处理的SK-BR-3 细胞的显微镜分析。与未处理的对照细胞相比，用anti-HER2 Diaffibody孵育的细胞未显示任何形态学变化，而用偶合物处理的细胞的活力受到严重影响。上海交大一名研究者通过自组装一种纳米胶束以延长Z(HER2:4)-MMAE靶向癌症治疗的循环时间[3]，这种基于affibody的纳米剂(Z(HER2:4)-MMAEADCM)在体内对HER2阳性卵巢和乳腺肿瘤模型显示出优异的抗肿瘤活性，几乎根除两个小的实体瘤(约100mm3)和已形成的大肿瘤(超过500mm3)。两种模型的相对肿瘤增殖抑制率均达到99.8%。

　　图十二：Z(HER2:4) -MMAE ADCM在 SKOV-3 异种移植小鼠中的生物分布

　　5.2  centyrins-药物偶联   Centyrins是基于人纤连蛋白的第10个III型纤连蛋白结构域的小型(~10 kDa)无半胱氨酸支架。这些支架包含多个环，这些环在结构上类似于IgG的互补决定(CDR)区域并赋予靶标特异性。它们只包含一个结构域，没有二硫键，可以很容易地在各种表达系统中表达。目前，半胱氨酸残基的位点特异性引入、马来酰亚胺连接子仍然是这种支架最常用的缀合策略。 5.3 胱氨酸结-药物偶联   胱氨酸结(Knottins)是长度为30-50个氨基酸残基的多肽(3-6kDa)，由于其高度紧凑的结构，具有显著的化学稳定性、蛋白酶稳定性和热稳定性。这些支架形成紧凑的三维(3D)结构，该结构由至少三个二硫键组成，并且可以设计为与多个目标结合。产生胱氨酸结的最常见方法是固相肽合成，然后是氧化折叠。尽管Knottins包含多个二硫键，但尚未探索二硫键桥接化学物质。通过无铜点击化学，叠氮残基可与Knottins的位点有效特异性结合。 5.4 DARPin-药物偶联   设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)是基于Akyrin重复的支架(~18KD)。典型的 DARPins由4-6个重复单元组成，每个重复单元的长度约为 33 个氨基酸。这些支架可以通过噬菌体展示或核糖体展示进行选择，并且可以通过大肠杆菌表达。通过半胱氨酸残基与支架的位点特异性结合，然后与马来酰亚胺接头反应，可以实现与 DARPins 的位点选择性结合。将叠氮同丙氨酸掺入DARPin的n端可以很容易地利用叠氮环加成点击化学进行化学共轭。 德国一名研究者基于anti-EGFR的锚蛋白重复蛋白(DARPin)E01构建了药物偶联物，并在体内体外实验中对二价DARPin(DD1) 、DARPin-Fc(DFc) 、单体DARPin(DM)和抗体衍生的scFv-SCFV(scFvFc)进行了比较[4]。

　　 图十三：二价DARPins 与普遍表达的 EGFR 非特异性结合

　　

　　图十四：只显示出了中等的抗肿瘤效果，但安全性较好

　　5.5   Abdurin-药物偶联   与大多数结合支架不同，Abdurins是基于工程化IgG CH2结构域的支架，保留了与FcRn受体结合的能力，具有延长血清半衰期的能力。大小仅为1/10(~15 kDa)，具有热稳定性，具有3个环，可以多样性地形成结合物库。