大拆解，全自动微流控核酸检测产品Mesa

　　引言

　　Mesa Biotech是一家位于美国加州圣地亚哥的分子诊断公司，该公司成立于2009年（成立之初公司名为Mesa Tech International）。该公司主要开发并销售了基于微流控技术的传染病快速即时检验平台 Accula，检测项目包括SARS-CoV-2（COVID-19）、A型和B型流感、呼吸道合胞病毒（RSV）和A群链球菌。该公司2020年报告的收入约为4,500万美元。

　　在2018年，海尔生物与旗下子公司海尔生物香港先后认购Mesa第一批、第二批B系列优先股，总共2000万美元。

　　2021年1月，赛默飞世尔科技宣布已经达成了一项最终协议，以约4.5亿美元的现金收购一家私人持有的分子诊断公司Mesa Biotech，Inc。根据协议条款，赛默飞世尔将在完成某些里程碑后再支付至多1亿美元现金。

　　Accula SARS-CoV-2测试是一种定性的，目视读取的测试，利用聚合酶链反应（PCR）技术通过咽拭子样本检测SARS-CoV-2。Mesa Biotech的分子POC冠状病毒测试（需获得监管机构的批准）将在大约30分钟内获得实验室质量的结果。Mesa Biotech的Accula?Flu A /Flu B（甲乙型流感）和RSV（呼吸道合胞病毒）测试已获得欧盟的CE标志，并获得了美国食品药品管理局（FDA）的510（k）许可和临床实验室改进修正案（CLIA）豁免。

　　值得注意的是，在2022年年初，FDA通报该产品被Mesa召回。主要原因是产品在生产制造过程中，生产设备被污染，导致该产品出现假阳性结果的风险增加。具体可以阅读

　　Mesa Biotech召回Accula SARS-CoV-2

　　https://www.fda.gov/medical-devices/medical-device-recalls/mesa-biotech-inc-recalls-certain-accula-sars-cov-2-tests-risk-false-positives-caused-contamination

　　该产品任博士前面也做了详细的分析。这里，笔者把本公司微流控技术团队之前整理的该产品的剖析也呈现出来，让大家更清晰的了解该产品的设计逻辑。

　　第1章Accula Dock

　　1.1Accula Dock分析仪概述

　　Mesa生物技术AcculaFlu A / Flu B甲乙流感检测采用多重RT-PCR技术，然后采用杂交技术和横向流动技术对甲乙流感进行定性的视觉检测，可以在30分钟或更短的时间内得到检测结果。

　　AcculaFlu A/ Flu B集成了核酸提取，扩增和杂交在一个独立的自动化系统上，和配套的试剂卡盒相结合。Accula测试试剂盒含有所有的酶和试剂，插入到Accula Dock仪器中，然后添加未经处理的鼻样本进行测试。

　　

　　1.2 仪器检测过程

　　样本制备：

　　将仪器放置在平整的桌面上，连接电源；

　　在鼻拭子缓冲液瓶上贴上患者的ID和日期；取出鼻拭子缓冲瓶的瓶盖，将拭子标本插入鼻拭子缓冲瓶，并将棉签靠瓶壁旋转5次，然后更换小瓶瓶盖，（注:鼻拭子缓冲液中提取的样品可在室温下保存1小时）；

　　检测过程：

　　打开仪器的最左端的按钮，待仪器屏幕显示“仪器准备好请插入卡盒”；

　　从铝箔袋里面取出测试试剂盒和移液管并在测试盒上标注患者的ID和日期；然后将测试试剂盒插入基座并压紧，此时并不关闭仪器的盖子；

　　试剂盒不拆下覆盖在样品端口上的铝箔片，翻转软管，然后取下瓶盖，吸取样本，在吸取的过程中保证移液管中无气泡；

　　取下测试试剂盒覆盖在样本端口的铝箔片并丢弃；然后将移液管尖端插入样本端口的底部，直到遇到阻力为止；用力挤压移液管的顶部球，将样本分入到试剂盒中（注：少量的样品坑内会留在一流室中）；关好仪器的顶盖，开始进行样本的测试。

　　当测试完成时，仪器的屏幕上会显示“测试完成读取结果”，拆卸卡盒，测试结果在1小时内完成解析。

　　注意事项：

　　采完样之后应立即测试样品。如果不可能，将棉签保存在原来的包装中，室温下保存2小时。从采集开始，棉签也可以在2-8℃的环境下保存24小时。再次测试前让样品达到室温。

　　在样本准备好进行测试之前，不要打开测试试剂盒的铝箔袋。测试必须在打开铝箔袋30分钟内开始。

　　结果解析：

　　

　　当在FLU A位置或FLU B任何位置出现蓝色线，C处有无蓝色线显示都判定结果为阳性，若NC位置出现蓝色线则判读为无效结果。

　　第2章试剂卡盒结构解析

　　2.1侧向流动检测

　　侧向流动检测使用的是免疫层析原理-通过毛细管作用使检测样本侧向流过基质，使抗原抗体结合，从而使这些复合物达到检测和可视化的目的。

　　侧向流动测试之类的快速测定由于它使用方便，能够快速提供检测结果，同时允许进行即时分析，可很好的替代在实验室中进行的更耗时的免疫分析。快速检测可用于定性检测患者体内产生的抗体，检测结果可服务于临床诊断并指导治疗方案。

　　2.2 试剂盒结构

　　本设计原理是用高度简化的侧向流动（LFM）色谱核酸样品制备方法、装置和集成体系用于有效地浓缩痕量样品并且除去核酸扩增抑制剂。

　　本设计使用侧向流动技术和被动流体流动控制系统，实现以下的组合：（1）分析物的快速免疫和捕获，如真核和原核细胞、病毒以及植物的细胞和材料；（2）特定的DNA或RNA序列的基于杂交的亲和捕获。

　　本设计还提供用于被动控制侧向流动测定中使用的不同溶液和多种溶液流动的侧向流动结构和侧向流动策动的反应顺序。

　　

　　2.2.1侧向流动系统

　　侧向流动样品制备（LFSP）装置可以包含样本接收区；免疫捕获区域；裂解区、核酸扩增区域以及预处理区。

　　样本接收区域：用于接收流体样品的等分式样的接收区域。

　　免疫捕获区域：与样品接收区域侧向流动接触的免疫捕获区域，在免疫捕获区域含有与生物颗粒或细胞上存在的配体反应的固定化抗体；免疫捕获区的制备方法：1.处理侧向流动基底（即硝化纤维）以便固定抗体以在基底上形成免疫捕获区域；2.抗体沉积到大孔硝化纤维膜上；3.抗体一旦沉积到基底上，则配体通过干燥或紫外线照射来固定。

　　裂解区域：在一些侧向流动装置中不包含裂解区域。其中裂解区域侧向流动接触的一个或多个测定区域，其一起形成用于夹心式核酸杂交测定的核酸和标记成分。

　　核酸扩增区域：在一些侧向流动装置中不包含核酸扩增区域。核酸扩增区域在裂解区域下游且与裂解区域侧向流动接触，并且在测定区域上游与测定区域侧向流动接触。

　　预处理区域：在一些侧向流动装置中不包含预处理区域。预处理区域包括聚乙烯吡咯烷酮处理的侧向流动装置元件用来捕获并减少核酸扩增反应抑制剂的方法，其可以与免疫捕获区域上游侧向流动接触或与样品区域下游侧向流动接触。

　　2.2.2被动侧向流动缓冲液交换系统

　　通过将侧向流动膜（如硝化纤维膜）或能支持毛细管流动/流体芯吸的其它吸水性材料（如色谱纸）切成不同的几何形状而实现被动溶液或缓冲液的流动控制。

　　利用多种硝化纤维结构以介导侧向流动基底上的缓冲液和样品流的被动控制。通过在单一集成硝化纤维或色谱纸中使用几何限定的流动路径，可以通过膜的长度或宽度的不同被动控制多个溶液或缓冲液的流速。用乙烯基切刀或激光切刀将硝化纤维条或者色谱纸等吸收性材料切割出来的交换结构，如下图所示：

　　为了验证硝化纤维膜基底的被动缓冲液流动控制，其具体的操作过程如下图所示：

　　在装置中加入样品、缓冲液、裂解缓冲液以及扩增缓冲液

　　样品通过宽的膜路径流动流动经过免疫捕获区域，将裂解和扩增缓冲液移动至邻近于基底壁的膜区域直到样品流完。

　　当样品用完时，裂解缓冲液进入免疫捕获区域，破坏捕获的颗粒并且释放核酸，用于LNA探针上的基于杂交的捕获，（LNA探针固定在下游LNA-捕获区域）；

　　在缓冲液用完后，与NASBA扩增相同的缓冲液洗涤LNA-捕获区域，出去残留的缓冲液并且促进引物杂交。

　　

　　2.2.3集成系统

　　样品-到-响应的侧向流动测定装置与免疫测定筛选和NASBA扩增以及随后的下游侧向流动夹心式杂交核酸测定集成的。如下图所示，该元件是由塑料外壳和硝化纤维制成，使用毛细管侧向流动和被动调节的原理，从而实现分析物亲和性杂交的捕获以及随后的裂解、洗涤和通过NASBA的等温扩增所需的缓冲液交换。使用免疫测定的操作过程如下：

　　在样品口中加样后样品体积约占腔室体积的10%；

　　然后进行细胞的分离和裂解使细胞中的RNA释放并通过胍盐基缓冲液进行稳定。

　　通过在胍盐缓冲液中杂交到LNA捕获寡核苷酸收集到目的RNA序列

　　

　　另一种设计方案是利用阴离子/阳离子交换来实现侧向流动测定装置。加入样本时将洗涤或裂解缓冲液加入到洗涤/裂解区域，在那里它从吸收垫经由窄的硝化纤维路径流动到主基底，仅在样品溶液的完全输送以后到达主要的路径。硝化纤维路径经过PVP或阳离子交换配体去除扩增抑制剂。高强度的离子洗涤缓冲液从阴离子交换配体中洗脱核酸并且提供支持有效结合到二氧化硅机制的静电环境。得到提纯的核酸可以通过二氧化硅机制的洗脱或收集被回收到携带玻璃料的微离心管中，在微离心管中核酸进行低离子强度缓冲液的洗脱。

　　

　　2.3 试剂盒结构

　　本设计原理是利用流体通过通道尺寸、液体静压力和表面张力的平衡保持在各个反应腔室中，其中表面张力和液体静压力通过气体置换来禁止流体前进。

　　2.3.1两腔室试剂盒

　　试剂盒2500的主体结构，包括多个腔室；连接到所述腔室的多个通气口袋；以及用于密封通气口袋的一个或多个热不稳定材料；热稳定材料；以及设置在热不稳定材料与热稳定材料之间的垫圈，其中垫圈包围多个通气口袋的开口。

　　核酸样品通过取样端口20添加到流控部件5中的取样杯10。滑动式密封件91通过在测定发起室闭合对接单元盖而移动到闭合位置。盖件25将滑动件91保持在适当位置，以便密封膨胀腔室52。试剂混合物16可用于促进细胞和病毒的裂解或使释放的核酸稳定；试剂混合物16可以是液体试剂也可以是冻干试剂，存在取样杯中或邻近取样杯的凹槽13中。

　　取样杯10中的样本通过通道40引导到第一腔室，试剂凹陷部15沿着入口通道定位，使得流体在进入第一腔室30之前循环过凹陷部分与其中的干燥或冻干的试剂共混。以逆转录为例：

　　1.逆转录所必须的所有组分存在于试剂凹陷部15中；

　　2.逆转录腔室30与加热器元件接触，以提供支持将RNA逆转录成cDNA所必须的温度；

　　3.通道35将腔室30连接到试剂凹陷部37；在腔室30中进行cDNA合成后，打开排放口50以允许逆转录反应产物通过通道35流入到试剂凹陷部37；

　　4.当流体穿过凹陷部通过入口39到达第二腔室90时，存在于试剂凹陷部37中的干燥或冻干试剂与流体共混，在第二腔室中完成扩增；

　　5.在核酸扩增后，打开通气口袋150以允许扩增反应产物通过通道135流入到腔室230中；

　　6.位于腔室230中的检测条带235使得能够检测由位于检测条带235或毛细管池93中的检测颗粒标记的靶核酸。

　　具体的操作过程：

　　1.腔室30通过开口51与膨胀腔室52通气而发生从取样杯10到第一腔室30的流体转移到第一腔室30的流体移动。当流体进入第一腔室30时，由于通气口袋50处于密封的状态，因此第一腔室30中的流体不会通过两个腔室的通道35进入到下一腔室。

　　2.当密封的通气口袋50的密封件破裂，腔室90中的空气通过通气口通道60与膨胀腔室52中的空气连通，膨胀腔室52通过开口51连接到通气口袋54。

　　3.通气口袋50的密封件破裂与通气口袋54以及膨胀腔室52连通，腔室30中的液体进入到腔室90中。

　　

　　热量从热源70通过通过热稳定材料72和密封空间55传递到热不稳定通气口袋的密封材料80，从而使通气口袋50破裂并打开。在通气口袋50打开之前，热源71已使通气口袋破裂，通气口袋54与膨胀腔室气体连通。

　　

　　2.3.2各部分组分

　　2.3.2.1膨胀腔室

　　与通气口袋的开口面相对的面含有凹窝、突起或其他类似结构，如下图所示，这种结构可以在通气口密封材料破裂期间形成开口，同时还可以防止密封件破裂后通气口的再密封。表面安装电阻器可拉伸聚酰亚胺膜，将其推入垫圈中的开口并抵靠热不稳定材料。一旦密封件破裂，熔化的密封材料就可与聚酰亚胺形成二次密封，从而形成闭合通气口。同时加热器可使聚酰亚胺柔性电路局部变形，形成延伸到垫圈中的开口中的突起，从而防止密封件破裂后通气口的再密封。

　　

　　膨胀腔室52通过缓冲空气或水蒸气体积、或提供较大的体积来消除因温度变化带来的气体膨胀，保证整个系统的压力不会发生显著的变化。如下图所示，膨胀腔室利用活塞密封的方式来密封测试盒，当气体膨胀时活塞发生移位，从而降低测试盒的内部压力。

　　

　　膨胀腔室或是利用囊状物来消除密封测试盒气体膨胀，当测试盒的气体膨胀时囊状物发生偏移，囊状物的移位降低测试盒内部压力。

　　

　　膨胀腔室还可以利用波纹管的拉伸来降低测试盒的内部压力。

　　

　　

　　2.3.2.2检测腔室及检测原理

　　检测腔室230对在扩增腔室中产生的扩增靶核酸进行特异性标记。检测腔室230包括毛细管池93和检测条带235。染料聚苯乙烯微球、胶乳、胶体金、胶体金纤维素、纳米金或半导体纳米晶体的检测颗粒可以存在毛细管池93中也可以以冻干的形式存在于检测腔室230或检测腔室的试剂凹槽通道135中。为了实现有效地进行有效的标记，将检测颗粒放置在通道135出口处的毛细管池93中，毛细管池可以实现颗粒的混合和分散，促进检测颗粒与所结合的核酸共混，同时毛细管池还能增加检测条带上颗粒迁移的均匀性，如下图所示。

　　

　　检测颗粒含有与靶分析物互补的寡核苷酸或含有能够结合扩增的靶核酸的配体，能够结合到由多重扩增的过程所产生的多种扩增核酸，在扩增期间引入到靶核酸的标签可用于标记存在的所有扩增物种，同时使用标记的核酸与固定在检测条带上的物种特异性捕获探针进行后续杂交来确定存在那种特定种类的扩增DNA。

　　以双链DNA的扩增产物为例：

　　1.双链的DNA扩增产物在引入到检测腔室后加热反应溶液可促进检测；

　　2.使双链DNA熔化或使单链DNA的二级结构变性，然后在检测寡核苷酸（检测颗粒）的存在下进行冷却使扩增的靶核酸的序列特异性标记。

　　检测是通过吸收条带毛细芯吸包含标记的扩增子的溶液来实现的。其中吸收条带包含用线、点、微阵列或其他视觉上可辨别的元素图案化，包含能够直接或间接特异性结合到标记的扩增子的结合部分的多孔材料，多孔材料如纤维素、硝酸纤维素、聚醚砜、聚偏二氟乙烯、尼龙、电荷改性尼龙或聚四氟乙烯。检测条带元件上固定捕获探针，捕获探针含有标记的核酸芯的溶液通过捕获区使捕获探针固定位点处的标记物浓度增加，从而产生一个或多个标记可检测信号时捕获标记的核酸。单个检测条带可用一个或多个捕获探针图案化，以实现多个扩增子的多重检测、扩增子序列的确定、通过扩展检测信号的线性进行的扩增子定量以及测定质量控制。

　　2.3.2.3流控部件

　　流控部件的组成，如下图所示。各部分组件通过.压敏粘合或超声波焊接的方式实现组合。

　　

　　2.3.3三腔室试剂盒

　　上述的试剂盒为两腔室试剂盒，三腔室试剂盒如下图所示,其构造与两腔室的构造相同。反应流程如下：

　　1.含有核酸的样品通过取样端口5001引入到取样杯5002中；

　　2.由于取样杯5002与顶部的通气口通道5007相连，样品自由地流入凹槽5003中，其沿通道5005向下流入第一反应腔室5006中之前在凹槽5004中与冻干球混合（冻干球包含裂解试剂）；

　　3.通气口通道5007通过孔洞5008连接到膨胀腔室5021。反应腔室5006下方的密封空气空间由于流体流动而略微加压，并使流体流动停止在第一反应腔室5006的正下方；然后第一反应腔室5006加热至一定的温度以促进裂解试剂释放反应，从而裂解样品中的生物颗粒或细胞；

　　4.连接第二反应腔室5011顶部的通气口阀5009打开然后是样品流入到第二凹槽中，样品在第二凹槽中与第二冻干球5010（冻干球含有用于逆转录的试剂）。接着流体进入第二反应腔室5011，在第二反应腔室中流体的流动由于流动下方闭合的空气体积中增加的空气压力而停止，同时在第二反应腔室5011中加热促进试剂的逆转录；

　　5.连接到第三反应腔室5013顶部的下一个通气口阀5009的打开室样品从第二反应腔室5011流过第三凹槽，样本与第三凹槽的冻干球5012进行混合（冻干球包含PCR扩增试剂）；然后样品流入到第三反应腔室5013中，在第三腔室中进行样品的扩增；

　　6.随后连接到侧向流动条带5014的远端的最终的通气口阀5009的打开使得现在包含扩增的分析物的样品能够流到侧向流动条带5014，用于检测分析物。

　　

　　

　　2.3.3.1流动控制特征

　　流体进入到如下图所示的结构中，进入腔室的流体偏转到与腔室出口相对的一侧。使流体以较低的速度进入到出口通道，由于增加了流体流动路径的有效长度，从而减少流体在停止之前沿通道向下流动的距离。同时对横跨反应腔室的流体在腔室中产生旋流作用，从而改善试剂与样品的混合。流体流动的过程如下：

　　1.流体从入口通道4002进入反应腔室4003并流动到反应腔室的底部；

　　2.流体通过三角形流动控制特征4001将流体偏转到反应腔室4003的与入口通道4002的开口相对的侧；

　　3.当流体继续进行到相对的拐角4004时，流体进行分离，其中一部分进入到出口4005，其余部分接触壁并被向上引导，从而产生旋流效应，从而实现了混合；

　　4.进入出口中的流体形成弯月面并通过出口通道4006朝向下一个腔室，由于出口通道4006的下方腔室被密封，因此流体沿着出口通道4006流动时，空气压力在管道的下方增大直到液体两侧压力的平衡，液体停止流动。

　　【特点】

　　出口4005从反应腔室4003到出口通道4006渐缩，这种通向出口通道的较大开口可以增大可压缩的空气的体积，在较宽开口处形成弯月面。

　　

　　如下图所示，流体流动过程与上述过程相同，出口4105和出口通道4106具有均匀的宽度，由于出口通道较为狭窄，从而增大了流体下游闭合空气空间中的压力。

　　

　　出口4205与出口通道4206具有均匀的宽度，使用较窄的通道，在反应腔室中形成的弯月面更加可靠。

　　

　　出口通道4306堆叠的串联流动控制特征，增大了流体出口通道的长度。

　　

　　如下图所示，流动控制特征4401使流体远离出口通道4405偏转到相对的拐角4404中，从而保证流体在离开腔室之前降低流速，此结构促进湍流和试剂的混合。

　　

　　为了促进反应溶液与冻干试剂的有效共混，试剂凹槽的设计有两种方式，一种为试剂凹槽设计在流体路径中，另外一种情况是试剂凹槽位于流体腔室内。前一种设计方式存在的弊端是在反应完成之前从上面的腔室渗漏（或毛细管滴流）。

　　

　　如下图所示，在单个测试盒中包括两个流体路径的试剂盒。每个流体路径可在时间、反应类型等方面独立控制。

　　

　　操作过程：

　　1.引入到取样杯1000的样哦恩被分成大约相等的体积并流入体积分离腔室1001和1002中，流入其中的流体由通气口阀1003和1004调控；

　　2.分离腔室1001和1002通过被动平衡每个腔室中的样品量来控制每个测试路径中的样品体积；

　　3.样本体积等分后，通过打开通气口1005和1006来允许溶液流过试剂凹槽1007和1008；

　　4.样品流过凹槽并进入第一组温控腔室1009和1010时，试剂凹槽中的冻干试剂与样品共混；

　　5.在第一腔室中完成逆转录和核酸的扩增的生化反应后，通气口袋1011和1012的密封件破裂流体从第一组腔室流过第二组试剂凹槽1013和1014、并流入第二组温控腔室1015和1016中，完成样本与试剂的共混。

　　6.通道打开通气口阀1019和1020允许溶液流入检测条带腔室1017和1018中，检测分析物。

　　检测条带可包括掺杂或图案化有干燥或冻干的检测试剂的一系列吸收材料；检测试剂包括检测颗粒、捕获探针和分析物的配体；以及用于提供足以确保样品溶液体积通过诸如毛细管作用或芯吸的方式完全迁移通过检测条带的吸收能力的吸收材料。

　　

　　2.3.3.2样品制备

　　样本制备子系统如下图所示。

　　

　　样品制备期间发生的样品制备子系统部件的移动如下图所示，在样品处理之前和处理之后的样品制备子系统实施方案的横截面。在洗脱之前，通过相关联的可重复使用测试仪器中的致动器的作用将结合基质1306移出毛细管流动路径，并通过密封部件1316与洗脱缓冲剂导管1318的一部分形成密封,以允许洗脱缓冲剂通过结合基质1306注入并进入取样杯1402中，而不会使溶液损失到样品制备子系统的毛细管中。

　　

　　通过超声波焊接或粘合的方式将试剂盒的各个部分组合起来。

　　

　　对接单元包括微控制器、MOSFET、开关、电源、冷却风扇、用户接口、红外温度传感器以及连接器。

　　

　　仪器的外观及检测试剂盒的放置位置如下图所示。

　　

　　检测试剂的密封结构如下图所示，可以为齿轮齿条结构也可以为旋转阀结构。

　　

　　

　　除了上述两种密封方式外，测试盒的密封件通过接合o形环来滑动密封取样端口（即放置在铰接的盒盖）,如下图所示。

　　

　　如下图所示，将光学传感器放置在检测试剂盒的封口处，光学传感器能够检测检测试剂盒取样端口密封件的状态，保证试剂盒开始检测之前密封件处于闭合状态，如果密封件未处于闭合状态，则测试程序终止。

　　

　　如下图所示的组件，保证了试剂盒能够正确的插入到仪器中，同时也确保了与试剂盒接口连接的电子部件对插入的试剂盒不会产生物理干扰，在测试期间形成可靠的热界面。

　　

　　在盖闭合之后，加热器板牢固地压靠在测试盒的后部，从而形成热界面。如下图所示，脱离接合（盖打开）位置和接合（盖闭合）位置两者的盒-PCA接口连接机构的横截面。

　　

　　为了实现参数的自动化选择，在仪器内部安装了红外传感器。

　　

　　2.3.4应用

　　病毒RNA（A/B型流感病毒）和内部阳性对照病毒的多重扩增和检测方法

　　【样本类型】

　　纯化的病毒RNA（A/B型流感病毒）；

　　缓冲剂中的病毒裂解物；

　　掺入阴性临床鼻腔样本中的（纯化）流感病毒。

　　【操作步骤】

　　1)将A型和B型流感病毒测试盒放入对接单元中；

　　2)将40ul样品溶液添加到取样端口；

　　3)在进入到取样端口时，40ul样品在其流动到测试盒的第一腔室时与冻干球共混；

　　4)在试剂盒的第一腔室中，将样品加热至90℃ 1min使病毒进行裂解，然后在打开连接第二腔室的通气口之前冷却至50℃；

　　5)打开连接第二腔室的通气口允许样品通过使第二腔室中的空气移位到膨胀腔室而流入到第二腔室中；

　　6)当样品移动到第二腔室时，样品与寡核苷酸扩增引物与A型流感病毒、B型流感病毒和MS2吞噬菌体共混，并且逆转录和核酸扩增试剂和酶以冻干球的形式存在于第一腔室和第二腔室之间的流体路径的凹槽中；

　　7)将扩增腔室加热至47℃6min，完成RNA的逆转录；

　　8)完成逆转录之后，在第二腔室中进行40个热循环进行扩增；

　　9)热循环完成后，打开连接到第三腔室的通气口，反应溶液流入到第三腔室中，在第三腔室中含有测试条带和冻干球；

　　10)当溶液进入到第三溶液时，溶液重构冻干的检测颗粒。将三条捕获线固定在侧向流动隔膜上，从底部向上依次为不与任何测定的靶标互补的阴性对照寡核苷酸；与B型流感病毒扩增产物互补的捕获探针；与A型流感病毒的扩增产物互补的捕获探针；以及与MS2吞菌体的扩增产物互补的寡核苷酸；

　　11)在目测结果之前，使用侧向流动条带显影达6min；

　　12)在侧向流动条带显影时，A型流感病毒阳性样品在A型流感病毒和MS2噬菌体位置处显示蓝色测试线；B型流感病毒阳性样品在B型流感病毒和MS2噬菌体位置处显示蓝色测试线，阴性样品仅在MS2噬菌体位置处显示蓝色测试线。

　　测试结果如下图所示：

　　

　　2.4用于核酸检测和鉴定的集成装置

　　2.4.1检查原理和方法

　　侧流测定由于使用容易、可靠和成本低而常用在免疫测定检测中。此专利中的平台用新一代的核酸检测来补充当前的免疫侧流快速测定，提供了更加信息化和灵敏的分析。其通过打开排气袋将包含靶核酸的溶液从一个腔室转移到下一个腔室，使用比色检测条来检测扩增的核酸。整个检测平台包括：样品腔、扩增腔、标记腔、检测子系统、多个电阻加热元件和一个或多个温度测量装置。

　　流体与电子层的图，如下图所示。

　　

　　在侧流条进行核酸检测时是使用的多孔材料作为样品接收带，使用多孔材料组成样品接收带和标记带可以使得一些样品溶液以及检测粒子保持在多孔材料中。而本专利使用的方案与常规的测流检测条不同，样品和检测粒子相互作用时间和条件是由材料的毛细管转运性质确定。通过在温度调节的腔室中结合检测粒子，发生双链体核酸的变性，有效的实现基于杂交的检测。

　　原理:

　　本方案使用在微控制器控制下的流体静压力以及毛细管作用力和表面张力来操作流体体积。装置垂直定向使反应液在微控制器的控制下从室到室的流注，从而适应测定所需要的操作。流体可以通过通道尺寸与表面张力的平衡而保持在单独的反应腔室中，其中表面张力通过气驱而阻止流体前进。样品紧在微控制器的控制下激活简单的排气机构后前进到下游的腔室中，一旦打开，借助于提供被驱离的空气随流体进入从第二腔室溢出，排气口的打开时流体从上一腔室流入到下一腔室。流体层内的每个腔室通过狭窄的排气通道与密封的排气袋连接；排气袋用一面薄塑料膜密封，通过加热膜下的小的表面贴装电阻器使膜破裂。

　　用于检测靶核酸的方法：

　　1.将含有靶核酸的样品放置在一次性平台的样品室中；

　　2.使一次性平台垂直或倾斜定向，样品与扩增试剂混合物反应；

　　3.反应结束后将与扩增室连接的第一排气袋向大气开放，反应的样品流入到扩增腔室，进行扩增；

　　4.将与标记室连接的第二排气袋向大气开放，扩增的靶核酸流到标记室中，在标记室中用检测粒子标记所扩增的靶核酸；

　　5.将与检测系统连接的第三排气袋向大气开放，标记的靶核酸进入到检测子系统中，并且检测所扩增的靶核酸。

　　2.4.2各部分组件

　　

　　样本流动原理：

　　在垂直定向上，流体柱的压力与其下密封的空气体积平衡。毛细作用防止空气溢出和进一步的流体推进；当在相对应的排气袋下的适当的排气口密封破裂时，流体通过出口通道移动到下一个腔室中进行进一步的处理。

　　样本混合步骤：

　　1)样本加入到样本腔10中与预置的冻干试剂20混合。混合的方式采用的气泡混合，所谓的气泡混合方式是指使用流体室下的加热器加热腔室中的溶液，如果溶液中包含热敏性成分，就会将溶液中的气体加热产生气泡，所产生的气泡传送到上部腔室的反应液中，实现溶液的混合；如果溶液中不包含热敏成分，加热器将腔室中的溶液加热到沸点。本方案中的垂直设计允许气泡上升至流体表面，仅导致最少的和短暂的流体驱离，有效地减轻了气泡对流体或微流体系统的任何不利的影响。通过煮沸的方式进行混合，当关闭加热元件后，煮沸的流体通过重力作用重新返回到初始的腔室中，最终实现溶液的混合。

　　2)样本与试剂充分混合后，然后将装置垂直定向，流体优先通过入口通道40导向位于样品室下方的一个或多个扩增腔30中，由于排气袋50通过薄膜80密封，使得流体柱的压力高于环境的压力，阻止液体的流动。一旦扩增反应完成后电阻器70产生热，热敏薄膜80破裂，排气口打开，为了维持压力平衡，液体沿出口管道45流入到标记腔90中。

　　

　　

　　在扩增壁95和加热元件100之间的界面处，放置导热材料保持对加热器和传感器110的导热性。微控制器调节到优选电阻加热元件的电流，优选地通过金属氧化物半导体场效应晶体管（MOSFETs）的方式，基于由温度传感器110（型号0402NTC）收集的数据，通过PID控制温度的方法来调节温度。

　　

　　如下图所示的装置中，利用气体的膨胀收缩促进液体流动的方法。通过加热扩增腔30，腔室内的气体膨胀气泡通过排气通道溢出，在加热的过程中，腔室内的液体产生大量的气泡从而实现腔室内的液体的混合。当加热元件关闭后，扩增腔30中的气体冷却并且收缩，将液体125从样本腔10中吸到扩增腔30中。这种通过气体膨胀收缩来控制液体流动的方法取决于管道的尺寸、长度、加热的温度和时间以及腔室的体积和流体的表面能。

　　

　　标记室的作用是为扩增腔中产生的扩增靶核酸提供特异性标记，并且与检测腔共同工作提供检测的分析结果。如下图所示，标记室90中包含检测粒子130，检测粒子为冻干型的双链DNA特异性结合的荧光染料。

　　

　　在标记室下方的电阻元件对腔室中的液体试剂进行加热，以使双链DNA解链。当液体试剂冷却至室温时，所扩增的靶核酸可以与检测微粒特异性杂交；然后通过打开检测室的排气口，液体试剂从标记室进入到下方的检测区域。为了发生有效的标记，溶解的检测粒子在加热沸腾的条件下与反应液充分混合。同时在标记室的侧面和底部含有激光刻蚀的线条如下图132所示，也可以实现溶液充分搅拌的作用。

　　

　　检测室对已在标记室中标记的扩增靶核酸的特异性检测。其检测过程如下：通过由多孔材料组成的吸收条毛细管芯吸收包含标记的扩增子的溶液而完成检测，其中吸收条能够直接或间接与所标记的扩增子特异性结合。

　　流体子组件层如下图所示，每个流体子组件包括三个层压的塑料片，其中一个部件200形成流体室的壁，另外两个面部件210、220层压成到第一以形成面。面部件210包含孔洞212用于观察LED指示器214。面部件220包含冻干试剂20、检测粒子130和检测条组件230，并且通过粘合垫片222与PCB75接口

　　

　　如下图所示，朝向流体组件的PCA侧面，其中加热元件是后膜电阻器，温度传感器紧邻加热器放置的小的SMD电热调节器。在组装流体层与电子层之前应用导热化合物确保在流体层、电阻器和电热调节器之间良好的热接触。

　　

　　用粘合垫片粘合到PCA上的流体盒，如下图所示。

　　

　　一次性的组件，如下图所示，通过9伏电池305通过端子307连接在装置的背面微控制器300、功率调节电路302和MOSTFETs310放置在装置的背面，其中与流体层接触的元件包括排气口加热元件70，扩增室加热元件100以及标记室加热元件265和温度传感器。

　　

　　多层流体盒式组件如下图所示，各层部件通过硅氧烷转移粘合剂粘合在一起

　　

　　流体层290的一次性测定检测盒350的分解图如下图所示。

　　

　　2.4.3应用

　　本设计可以用来检测一种或多种靶核酸序列在样品中的存在，其中靶序列可以是DNA或RNA。也可以用来鉴定核酸的多态性，包括核苷酸多态性、缺失、插入、倒置和序列重复。也可以用来检测基因调节事件，如在转录水平的基因上调和下调。因此其应用为：

　　检测并鉴定在农业、临床、食品、环境和兽医样品中的病原体核酸；

　　检测疾病的遗传生物标记物；

　　响应于病原体、毒素、其他致病因子、环境刺激或代谢状态的相关生物标志物来诊断疾病或代谢状态，如基因调节事件（mRNA的上调或下调，或诱导小RNAs，或在疾病或代谢状态过程中产生的或抑制的其它核酸分子）。

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