创新速递｜“魔法子弹”ADC药物筛选全解析

　　1. 概要

　　抗体偶联药物（ADC）通过将具有细胞毒性的有效载荷偶联到抗体上从而使靶向化疗的概念重新焕发生机。复杂的ADC胞内毒素传递过程的第一个阶段是ADC药物的内吞，分析靶受体和ADC的内吞作用可以极大地促进临床前研究、临床转化和患者治疗效果。三优生物体外药效平台可以提供最齐全的内吞方法，助力ADC药物精准高效筛选。

　　2. ADC发展历程

　　早在20世纪初，德国科学家保罗·埃尔利希就已经提出了ADC的概念，但是受限于当时落后的技术条件，ADC长期停留在概念阶段。2011年8月19日FDA批准Adcetris治疗霍杰金淋巴瘤（HL）和系统性间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）；2013年罗氏的恩美曲妥珠单抗（T-DM1）在美国上市，标志着ADC药物研发技术真正成熟并取得商业化成功。

　　2017~2020年是ADC药物快速发展的时期。2017年上市的奥英妥珠单抗Besponsa用于治疗复发或难治性前B细胞急性淋巴细胞性白血病; 次年，莫塞妥莫单抗作为一种冻干粉剂的ADC药物上市；2020年4月，Trodelvy获得美国FDA加速批准,是FDA批准的第一个专门治疗复发或难治性mTNBC的ADC药物，也是FDA批准的第一个以Trop-2为靶点的ADC药物。

　　随后ADC药物发展进入成熟期。2020年1月，T-DM1获得NMPA批准在中国上市，开启了中国ADC药物元年，2022年4月24日，阿斯利康&第一三共联合开发的德喜曲妥珠单抗（DS8201）在中国申请上市。两年时间，中国ADC药物市场从无到有，快速加入全球ADC药物市场。

　　

　　3. ADC市场表现

　　?3.1. 销售额

　　

　　全球ADC药物市场增长迅速。2014年全球ADC药物市场规模为4.6亿美元，2020年ADC药物市场已增至25.1亿美元，复合增长率约为32.9%；预计2025年ADC市场体量可以达到210.7亿美元，复合增长率超过50%。

　　

　　?3.2. 临床靶点

　　表1. 临床阶段有1-2个ADC药物的靶点

　　

　　热门靶点的临床进展如图所示，Her2靶点在研的ADC药物有23个，EGFR和FRA靶点在研的药物有7个。临床阶段有1-2个ADC药物的靶点见表1。差异化布局，寻找合适的药物靶点已经成为ADC研发企业争夺的热点。

　　

　　?3.3. 临床阶段

　　表2. 临床III期和批准上市的ADC药物信息

　　

　　目前，处于上市的ADC药物有8个；临床III期的ADC药物有14个，临床II/III期的ADC药物有2个，临床III期和批准上市的ADC药物信息见表2，随着全球ADC药物获批数量的增多，可以预见，在中国政府鼓励创新和加快临床急需药品进入中国的政策环境下，将有越来越多的国内药企开始布局ADC药物研发，ADC药物研发会进入高速发展的时期。

　　4. ADC药物筛选关键点、原理

　　?4.1. DS-8201

　　8月12日，美国FDA宣布，加速批准阿斯利康和第一三共联合开发的ADC药物Enhertu（DS-8201）扩展适应症，用于治疗携带激活性HER2突变的无法切除或转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者。这是FDA批准治疗HER2突变NSCLC的首款药物。

　　值得一提的是，这是FDA批准治疗HER2突变NSCLC的首款药物。此前，FDA已批准DS-8201用于HER2低表达或阳性乳腺癌和胃/胃食管交界（GEJ）腺癌患者。

　　在今年的ASCO大会上，DS-8201为HER2低表达乳腺癌患者的命运带来转机。根据临床结果，DS-8201将HER2低表达乳腺癌患者无进展生存期延长了半年，总生存期延长了10个月。

　　DS-8201首次突破HER2界限，这不仅是它一个人的成功，更称得上是HER2靶点研发的一大里程碑事件。

　　

　　?4.2. ADC药物机制

　　ADC通过血液循环到达癌细胞时，ADC首先与相应的抗原结合，通过受体介导的细胞内吞作用进入细胞内。连接子在细胞内低pH值或溶酶体蛋白作用下断裂，释放出具有活性的细胞毒药物。游离的小分子细胞毒药物与相应的靶标结合，导致肿瘤细胞死亡。

　　

　　?4.3. ADC药物核心要素

　　抗体偶联药物（Antibody drug conjugation, ADC），包括抗体、连接子和小分子药物三个核心要素。

　　

　　https://en.wikipedia.org/wiki/Antibody-drug_conjugate

　　ADC药物的关键在于4个核心要素的选择：

　　1) 正确靶标的选择：在肿瘤细胞表面高表达，在正常组织中低表达或者不表达；

　　2) Linker的选择：循环稳定、水溶性、有效释放、可分裂的链接器、旁观者效应、位点特异性结合、Drug-to-antibody ratio（DAR）；

　　3)?抗体的选择：与靶点特异性结合、靶向抗原需为细胞表面抗原、高效内化（Internalization）；

　　4) ADC小分子毒性：高效的药效学作用，无免疫原性，通过修饰能与连接子结合。如何鉴定抗体的内化是ADC项目推进的关键。

　　5. 三优生物抗体内吞检测平台

　　基于ADC的研究，我们需要高效、稳定、便捷、高通量的方法进行抗体内吞检测，三优生物可以提供以下最齐全的内吞检测方法：

　　1）方法及原理

　　

　　2）方法属性

　　

　　3）服务内容（一站式服务及交付、量身定制）

　　6. 丰富的经验证的靶点细胞株及对照品

　　

　　7. 三优生物ADC项目案例展示

　　?7.1. TROP2项目

　　7.1.1. 单荧光法检测Sacituzumab被hu-TROP2-HEK293内吞

　　

　　图1. 单荧光法检测Sacituzumab被

　　hu-TROP2-HEK293内吞曲线图

　　用荧光二抗标记细胞外结合的抗体，通过流式细胞仪检测抗体标记的荧光值，计算抗体被细胞内吞后胞外荧光值的差值占内吞前荧光前的比值，从而得到内吞率。随时间的变化，Sacituzumab被hu-TROP2-HEK293内吞率逐渐增多，在3 h达到最高值35%。

　　7.1.2. 双荧光法检测Sacituzumab被hu-TROP2-HEK293内吞

　　

　　图2. 双荧光法检测Sacituzumab被

　　hu-TROP2-HEK293内吞曲线图

　　用荧光二抗标记细胞内外抗体，通过流式细胞仪检测抗体标记的荧光值，计算细胞内荧光占总荧光的比值，从而得到内吞率。随时间的变化，Sacituzumab被hu-TROP2-HEK293内吞率逐渐增多，在3 h达到最高值15%。

　　7.1.3. pH-rodo法检测Sacituzumab被hu-TROP2-HEK293内吞

　　

　　图3. pH-rodo法检测Sacituzumab被

　　hu-TROP2-HEK293内吞曲线图

　　用pH-rodo试剂标记抗体，pH-rodo染料在中性pH值下不发荧光，溶酶体内酸性环境使pH-rodo染料产生明亮的荧光，利用流式细胞仪检测细胞荧光强度的方法来检测抗体内吞率，随着时间的变化，Sacituzumab浓度为60 nM时被hu-TROP2-HEK293内吞比率逐渐增大，在24 h达到最大值80%。

　　7.1.4. 激光共聚焦法检测Sacituzumab被hu-TROP2-HEK293内吞

　　将未标记的IgG抗体与含有荧光团标记Fab片段的Zenon pH-rodo iFL IgG标记试剂孵育。标记的Fab片段与IgG抗体的Fc部分结合形成标记复合物，抗体复合物的形成时间少于5分钟，pH-rodo? iFL染料随着其周围环境的pH值酸性增强而显著增强荧光。用pH-rodo试剂标记抗体，pH-rodo染料在中性pH值下不发荧光，溶酶体内酸性环境使pH-rodo染料产生明亮的荧光，利用激光共聚焦显微镜对细胞进行拍照，观察细胞内抗体定位及抗体内吞量。

　　7.1.5. Fab-zap法检测Sacituzumab抗体被hu-TROP2-HEK293内吞

　　

　　图4. Fab-zap法检测过表达细胞株hu-TROP2-HEK293上

　　Sacituzumab抗体内吞率

　　用Fab-zap试剂和抗体偶联，抗体引导ZAP复合物到达目的细胞，随后与目的细胞结合并内化。ZAP复合物进入细胞质后，连接子（Linker）被酶解，释放Saporin杀伤细胞。抗体复合物和细胞共孵育48 h后，通过检测抗体复合物对细胞的杀伤来计算抗体的内吞率，48 h后，Sacituzumab被hu-TROP2-HEK293内吞比率随抗体的浓度加大而增大，在抗体浓度为0.4 nM时内吞率达到70%。

　　7.1.6. Fab-zap法检测Sacituzumab抗体被NCI-H292内吞

　　

　　图5. Fab-zap法检测肺癌细胞NCI-H292上

　　Sacituzumab抗体内吞率

　　抗体复合物和NCI-H29细胞共孵育48 h后，通过检测抗体复合物对细胞的杀伤来计算抗体的内吞率，48 h后，Sacituzumab被NCI-H292细胞内吞比率随抗体的浓度加大而增大，在抗体浓度为0.4 nM时内吞率达到70%。

　　7.1.7. Sacituzumab偶联ADC药物对NCI-H292细胞的杀伤

　　

　　图6. 抗体偶联ADC后检测对NCI-H292细胞的杀伤

　　用小分子药物和抗体偶联，抗体引导偶联物到达目的细胞，随后与目的细胞结合并内化。复合物进入细胞质后，连接子（Linker）被酶解，释放小分子毒素杀伤细胞。抗体复合物和细胞共孵育72 h后，通过检测细胞的活率来检测复合物对细胞的杀伤率，72 h后，Sacituzumab和小分子毒素复合物对NCI-H292细胞杀伤率随抗体的浓度加大而增大，在抗体浓度为250 nM时杀伤率达到90%。

　　?7.2. R1项目

　　7.2.1. 单荧光法检测99961.1被hu-ROR1-HEK293内吞

　　

　　图7. 单荧光法检测99961.1被huROR1-HEK293内吞曲线图

　　用荧光二抗标记细胞外结合的抗体，通过流式细胞仪检测抗体标记的荧光值，计算抗体内吞前后胞外荧光值的差值占内吞前荧光值的比值，从而得到内吞率。随时间的变化，99961.1被hu-ROR1-HEK293内吞率逐渐增多，在3 h达到最高值10%。

　　7.2.2. 双荧光法检测99961.1被hu-ROR1-HEK293内吞

　　

　　图8. 双荧光法检测99961.1被huROR1-HEK293内吞曲线图

　　用荧光二抗标记细胞内外抗体，通过流式细胞仪检测抗体标记的荧光值，计算细胞内荧光占总荧光的比值，从而得到内吞率。随时间的变化，99961.1被hu-ROR1-HEK293内吞率逐渐增多，在3 h达到最高值8%。

　　7.2.3. pH-rodo法检测99961.1被hu-ROR1-HEK293内吞

　　

　　图9. pH-rodo法检测99961.1被huROR1-HEK293内吞曲线图

　　用pH-rodo试剂标记抗体，pH-rodo染料在中性pH值下不发荧光，溶酶体内酸性环境使pH-rodo染料产生明亮的荧光，利用流式细胞仪检测细胞荧光强度的方法来检测抗体内吞率，在24 h时，9996.1浓度为60 nM时被hu-ROR1-HEK293内吞率达到最大值为46%。

　　7.2.4. Fab-zap法检测99961.1被hu-ROR1-HEK293内吞

　　

　　图10. Fab-zap法检测过表达细胞株

　　hu-ROR1-HEK293上99961.1抗体内吞率

　　抗体复合物和hu-ROR1-HEK293细胞共孵育48 h后，通过检测抗体复合物对细胞的杀伤来计算抗体的内吞率，48 h后，99961.1被hu-ROR1-HEK293细胞内吞比率随抗体的浓度加大而增大，在抗体浓度为0.4 nM时内吞率达到70%。

　　7.2.5. 99961.1偶联ADC药物对K562细胞的杀伤

　　

　　图11. 抗体偶联ADC后检测对K562细胞的杀伤

　　抗体复合物和K562细胞共孵育96h后，通过检测细胞的活率来检测复合物对细胞的杀伤率，96 h后，99961.1和小分子毒素复合物对K562细胞杀伤率随抗体的浓度加大而增大，在抗体浓度为1000 nM时杀伤率达到最大。

　　?7.3. BCMA项目

　　7.3.1 单荧光法检测GSK2857916被NCI-H929内吞

　　

　　图12. 单荧光法检测GSK2857916被NCI-H929内吞曲线图

　　用荧光二抗标记细胞外结合的抗体，通过流式细胞仪检测抗体标记的荧光值，计算抗体内吞前后胞外荧光值的差值占内吞前荧光值的比值，从而得到内吞率。随时间的变化，GSK2857916被NCI-H929内吞率逐渐增多，在3 h达到最高值70%。

　　7.3.2 双荧光法检测GSK2857916被NCI-H929内吞

　　

　　图13. 双荧光法检测GSK2857916被NCI-H929内吞曲线图

　　用荧光二抗标记细胞内外抗体，通过流式细胞仪检测抗体标记的荧光值，计算细胞内荧光占总荧光的比值，从而得到内吞率。随时间的变化，GSK2857916被NCI-H929内吞率逐渐增多，在3 h达到最高值20%。

　　7.3.3 pH-rodo法检测GSK2857916被NCI-H929内吞

　　

　　图14. pH-rodo法检测GSK2857916被NCI-H929内吞曲线图

　　用pH-rodo试剂标记抗体，pH-rodo染料在中性pH值下不发荧光，溶酶体内酸性环境使pH-rodo染料产生明亮的荧光，利用流式细胞仪检测细胞荧光强度的方法来检测抗体内吞率，随着时间的变化，GSK2857916浓度为60 nM时被NCI-H929内吞率随逐渐增大，在24 h达到最大值60%。

　　7.3.4 Fab-zap法检测GSK2857916被NCI-H929内吞

　　

　　图15. Fab-zap法检测过表达细胞株

　　NCI-H929上GSK2857916抗体内吞率

　　用Fab-zap试剂和抗体偶联，抗体引导ZAP复合物到达目的细胞，随后与目的细胞结合并内化。ZAP复合物进入细胞质后，连接子（Linker）被酶解，释放Saporin杀伤细胞。抗体复合物和细胞共孵育48 h后，通过检测抗体复合物对细胞的杀伤来计算抗体的内吞率，48 h后，GSK2857916被NCI-H929内吞比率随抗体的浓度加大而增大，在抗体浓度为2 nM时内吞率达到80%。

　　7.3.5 GSK2857916偶联ADC药物对细胞的杀伤

　　

　　图16. 抗体偶联ADC后检测对NCI-H929细胞的杀伤

　　抗体复合物和NCI-H292细胞共孵育120 h后，通过检测细胞的活率来检测复合物对细胞的杀伤率，120 h后，抗体和小分子毒素复合物对NCI-H292细胞杀伤率随抗体的浓度加大而增大，在抗体浓度为0.25 μg/mL时杀伤率达到最大。

　　8. 质量体系

　　目前三优生物质量体系设有四级文件管理体系，详细文件体系架构如下：第一层为质量手册，第二层分为质量政策要求、质量术语和制造检定规程（工艺规程），第三层分为标准操作规程SOP（细分为6大类：①一般通用管理/操作，②工艺操作，③检测方法，④设备/系统操作，⑤设备/系统维护保养操作，⑥计量校验操作）、表格FORM、方案和标准，第四层为各种表单、培训记录、实验记录、检验报告、验证报告等。该体系运行3年以来，执行中的操作规程文件共200余份，表格记录共150余份，以上文件均处于批准受控状态，已涵盖创新研发部、质量保证部、项目部、综合管理部、财务部、人力资源部、产程开发部、工程管理部等公司运营的各个环节，保障了公司质量系统稳健运行。

　　9. 关联服务

　　

　　10. Assay平台场景展示

　　

　　关于三优生物

　　三优生物是一家专注于创新生物药物研发和服务的生物高科技企业。公司致力于打造国际领先的创新生物药高质量、高通量、集成化研发及价值转化平台，构建治疗、研发和诊断类产品与服务的业务生态系统，协同全球生物制药、诊断及药物研发公司，打开人类疾病诊断和治疗的新局面。

　　三优生物建立了20000余平方米、设施设备先进齐全的创新生物药物一体化研发实验室。打造了以系列万亿级噬菌体展示抗体库为代表的，涵盖创新生物药发现、创新生物药优化、生产用细胞株构建、上下游工艺开发、临床前研发及产业化开发等50多个核心创新技术平台。构建了“差异化CRO、创新型CPO、特色CRS”于一体的业务体系。公司持续推出“品质最好、速度最快、性价比最高” （三优）的新技术、新产品、新服务和新场景。公司已和全球500多家制药公司、药物研发机构、诊断试剂产品公司建立了友好的业务合作关系。