细胞实验验证基因功能常见思路解析

　　

　　当通过组学、文献、芯片等数据预测某个基因可能在某个生物学过程中发挥功能时，那么下一步该如何验证呢？这是大部分的科研僧都会遇到的问题，其中具体的方式有很多种，一般都需要根据实际情况分析，但是常规基础思路可以给大家分享一下，大部分的验证功能都是可以通过此方案进行，若本基因有一些特殊作用可以相对应添加特殊实验，比如油红O染色、鬼笔环肽染色、活死染色等。

　　一、实验材料： 疾病对应的细胞系（或者是原代细胞），预算充足情况下可以选择2种细胞系，暂定为：A和B细胞

　　二、实验方案：敲低两种细胞的目的基因1、过表达两种细胞的目的基因1（若是miRNA可以使用mimics、inhibitor）

　　三、干扰片段筛选：2种细胞都需要筛选（当用mimics和inhibitor时也需要初步筛选表达效果）

　　目的基因1干扰片段筛选：针对目的基因1设计并合成3条siRNA及NC，转染细胞，QPCR筛选出干扰效果最好的片段进行后续实验；

　　四、实验分组：A或B细胞

　　1） A

　　2） A+siRNA NC对照组

　　3） A+siRNA目的基因1干扰

　　4） A+过表达目标基因1

　　5） A+过表达空载

　　6） 抑制剂处理浓度1

　　五、检测项目：

　　1） 细胞增殖或者细胞毒性检测（CCK法/MMT），

　　2） 流式检测细胞周期，

　　3） 流式检测细胞凋亡，

　　4） 细胞侵袭实验（transwell），迁移、划痕

　　5） WB检测细胞信号通路中蛋白的表达变化，

　　6） QPCR检测信号通路中基因的表达，

　　7） 免疫荧光检测下游信号通路蛋白

　　8） 流式多色检测某些marker指标

　　9） Coip检测A和B蛋白是否结合

　　10） 双荧光素酶检测A和B是否结合

　　11） 油红O染色

　　12） 生化检测：SOD，CAT等

　　13） 透射电镜

　　六、实验结果（上述检测类似结果，非本实验的实际结果）

　　1. 细胞增殖（CCK8）/MMT

　　

　　此实验通过CCK8的方法证明了A、B、C细胞和肿瘤细胞之间的抑制作用。

　　2. 流式检测细胞周期

　　

　　

　　流式细胞仪检测细胞周期，判断不同药物处理下的细胞的DNA复制情况，细胞周期是否受影响。

　　3. 流式检测细胞凋亡

　　

　　

　　通过流式细胞仪检测不同处理下细胞的凋亡状况，确实药物或者某基因是否调控了细胞凋亡信号通路。

　　4. 细胞侵袭实验（transwell），迁移、划痕

　　

　　

　　

　　通过上述实验，测试细胞在不同处理下的细胞本身能力，判断药物或者某个基因的影响。

　　5. WB检测细胞信号通路中蛋白的表达变化

　　

　　通过western blot方法检测不同药物处理下目标蛋白的表达量变化情况，判断哪些信号通路参与了上述药物处理过程，是研究分子机制的关键检测方法。

　　6. QPCR检测信号通路中基因的表达

　　

　　

　　通过QPCR的检测，判断不同处理下细胞内某些基因的RNA表达水平，判断这些基因是否参与了上述分子机制。

　　7. 免疫荧光检测下游信号通路蛋白

　　

　　

　　

　　

　　通过免疫荧光的方式，可以判断在不同细胞处理下目标蛋白A和B的表达强弱，定位以及是否共定位等目的。

　　8. 油红O染色

　　

　　通过油红O染色判断不同处理下细胞内脂肪情况，判断不同处理不对脂肪生产情况的影响。