贴壁细胞免疫荧光染色

　　免疫荧光染色实验是细胞生物学中检测蛋白表达的常见方法，如何做好免疫荧光染色实验尤为重要。

　　1. 细胞爬片

　　免疫荧光实验用到的原理是抗原与抗体特异性结合。因此为了便于操作，通常将细胞接种在盖玻片上。而细胞很难在盖玻片上生长，所以在开始实验前要将盖玻片以多聚赖氨酸包被。将盖玻片浸泡在消毒酒精中过夜，镊子夹取一片盖玻片并在酒精灯旁烘干，待其冷却后放入六孔板。以免温度过高导致六孔板底部融化。加入多聚赖氨酸溶液，以覆盖盖玻片为准，避光孵育30分钟以上，然后吸去液体，风干以备用。

　　进行细胞接种前，要算好要接种细胞的量，一般对于观察单个细胞的蛋白表达，细胞数要少，以保证在高倍镜下没有其他细胞干扰。细胞接种在后进行相应染色前细胞预处理。

　　2. 免疫染色

　　细胞在进行免疫荧光染色前需要对细胞进行多聚甲醛固定以及细胞膜通透化处理，这里主要是用Triton X-100破膜剂。细胞进行通透化处理后，还要用牛血清白蛋白BSA封闭20分钟。然后就可以进行一抗孵育了，一般一抗孵育不需要避光，室温下孵育2小时或者4度冰箱孵育过夜。如果是把抗体直接递到盖玻片上，这样会造成抗体试剂的浪费，我们可以找个旧的载玻片，并在上面贴上宽度大于盖玻片的封口膜。然后把稀释好的抗体滴在封口膜上，这样的话每张片子只需要10-20微升稀释后的抗体。当然了，在放盖玻片时要看清正反面，细胞面朝向封口膜。按照同样的操作步骤进行二抗孵育，此时就要避光了。最后还需要然细胞核，可以用DAPI或Hoechst 33258染料染色，方法跟一抗二抗孵育方式类似。

　　染色结束后，要进行封片保存，同时也要滴加抗荧光衰减剂。盖玻片的边缘可用指甲油涂抹，但是要注意保持通风。自然风干后就可以在显微镜下观察了。

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