关于荧光显微镜最新的技术进展

　　最近，仪器圈又出了个大新闻，科学家研发了新的荧光显微镜。

　　部分摘录如下：

　　在最近发表在《科学进展》上的一项研究中，科学家开发了一种不需要机械扫描就能获得荧光寿命图像的新方法。

　　荧光显微镜广泛用于生物化学和生命科学，而传统荧光显微技术的主要局限性是其结果难以定量评价，而且荧光强度受实验条件和荧光物质浓度的显著影响。现在，日本科学家的这项新研究或将改变荧光寿命显微镜领域。

　　小谱看完把新闻分享到了朋友圈，吃瓜群众纷纷表示对这个领域不太了解。小谱决定，在这里扒一扒荧光显微镜。

　　一、荧光显微镜的工作原理及结构

　　荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。

　　荧光显微镜工作原理

　　荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。荧光光源——般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。

　　荧光照明器

　　个别厂家的荧光光源收光镜在质量上有消色差和复消色差两种,前者可满足常规工作,特殊研究可选后者。如果观测样品荧光亮度强,可选配适当透过率的ND滤光片。

　　激发/发射滤光片组件

　　理论上应当针对拟使用的荧光色素或样品的荧光特性选择对应波谱的激发/发射荧光组件,做到合理搭配,但由于组件的种类繁多且价格较贵,一般常配宽带/长通滤光片组件。如果实验条件明确,则可以选择窄带/短通组件,如GFP、FISH观察。当然还有多波长组合,同时观测多个荧光光谱。除荧光显微镜生产厂家外,还可以向专门生产激发/发射滤光片的厂家订购。

　　反光镜

　　反光镜的反光层一般是镀铝的，因为铝对紫外光和可见光的蓝紫区吸收少，反射达90%以上，而银的反射只有70%；一般使用平面反光镜。

　　激光镜

　　专为荧光显微镜设计制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明视野聚光器的暗视野聚光器两种。还有相差荧光聚光器。

　　（1）明视野聚光器 在一般荧光显微镜上多用明视野聚光器，它具有聚光力强，使用方便，特别适于低、中倍放大的标本观察。

　　（2）暗视野聚光器 暗视野聚光器在荧光显微镜中的应用日益广泛。因为激发光不直接进入物镜，因而除散射光外，激发光也不进入目镜，可以使用薄的激发滤板，增强激发光的强度，压制滤板也可以很薄，因紫外光激发时，可用无色滤板（不透过紫外）而仍然产生黑暗的背景。从而增强了荧光图像的亮度和反衬度，提高了图像的质量，观察舒适，可能发现亮视野难以分辨的细微荧光颗粒。

　　（3）相差荧光聚光器 相差聚光器与相差物镜配合使用，可同时进行相差和荧光联合观察，既能看到荧光图像，又能看到相差图像，有助于荧光的定位准确。一般荧光观察很少需要这种聚光器。

　　物镜

　　各种物镜均可应用，但最好用消色差的物镜，因其自体荧光极微且透光性能（波长范围）适合于荧光。由于图像在显微镜视野中的荧光亮度与物镜镜口率的平方成正比，而与其放大倍数成反比，所以为了提高荧光图像的亮度，应使用镜口率大的物镜。尤其在高倍放大 时其影响非常明显。因此对荧光不够强的标本，应使用镜口率大的物镜，配合以尽可能低的目镜（4×,5×，6.3×等）。

　　显微照相装置

　　要求应当是自动机型但有手动控制功能,需设有专用于荧光照相的拍摄模式,因荧光镜像的背景或物像较暗,最好配置有照明调焦标线的取景放大镜,以利于调焦。

　　数字CCD相机

　　数字CCD成像技术发展甚快,与显微镜配套使用的数字CCD相机种类较多。追求分辨率固然重要,但若获取好的显微荧光成像质量,还要考虑CCD的成像方式、灵敏度、成像速度、芯片对所用荧光素发射波长的量子利用效率等技术参数。满足一般荧光成像应采用科学级芯片,最好是冷CCD,以消除荧光成像遇到的暗流(Dark Current)干扰。

　　二、荧光显微镜的分类

　　荧光显微镜就其光路来分有两种：

　　透射式荧光显微镜

　　激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上．这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱。所以对观察较大的标本材料较好。

　　透射式荧光显微镜工作原理

　　落射式荧光显微镜

　　落射式荧光显微镜这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45度角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。缺点是在用低倍率物镜时，像比较暗因此必须用大数值孔径的物镜，滤光镜系统必须有效地分离开激发光和荧光。

　　落射式荧光显微镜工作原理

　　三、荧光显微镜与普通显微镜的区别

　　荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：

　　1、照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上；

　　2、光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；

　　3、有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人眼。

　　荧光显微镜也是光学显微镜的一种，主要的区别是二者的激发波长不同。由此决定了荧光显微镜与普通光学显微镜结构和使用方法上的不同。

　　四、无需扫描？新发明带来哪些变革？

　　新荧光显微镜可以实现不需要机械扫描就获得荧光寿命图像。领导这项研究的日本德岛大学Post-LED光子学研究所教授Takeshi Yasui表示，“我们能在2D空间上同时映射44400个‘光秒表’来测量荧光寿命——所有这些都在一次拍摄中，不需要扫描。”

　　研究人员使用光学频率梳作为样品的激发光。一个光学频率梳本质上是一个光信号，它们之间的间隔是恒定的。研究人员将一对激发频率梳信号分解为具有不同强度调制频率的单个光拍信号（双梳光拍），每个光拍携带单个调制频率，辐照到目标样品上。而且，每束光束都在一个不同的空间位置击中样本，在样本二维表面的每个点和双梳光拍的每个调制频率之间形成一一对应的关系。研究人员用数学方法将测量信号转换为频域信号，根据调制频率处的激发信号与测量信号之间存在的相位延迟，计算出每个像素处的荧光寿命。

　　Yasui表示，这将有助于动态观察活细胞，还可以用于多个样本的同时成像和抗原检测——这种方法已经被用于新冠肺炎的诊断。该技术还有助于开发出新的顽固性疾病疗法，提高预期寿命。

　　内容来源：仪器信息网

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