CUT&Tag技术：研究组蛋白乳酸化修饰调控心肌梗死后修复机制

　　心梗

　　，也称心肌梗死，也就是给心脏供血的血管被血栓堵死从而导致心肌缺血、坏死。心肌梗死已经是人类心血管疾病中的“头号杀手”， 往往在短时间内对人体造成巨大的伤害，上至八九十岁，下至二十岁都有可能发病。

　　有研究表明，单核细胞-巨噬细胞中修复信号的早期激活对于及时恢复免疫稳态和心梗后修复过程的启动至关重要。然而，目前尚不清楚在心梗的早期炎症阶段，骨髓（BM）和循环单核细胞是否在心脏募集前被预先教育以启动修复性转录反应。此外，参与外周血单核细胞早期远程修复基因激活的机制和分子线索仍有待完全阐明。

　　组蛋白乳酸化最早报道于2019年，通过在组蛋白赖氨酸残基上添加乳酰基来调节组蛋白，并促进特定的基因转录。研究发现组蛋白乳酸化在肠道炎症、败血症、肺纤维化和其他免疫相关病理条件中的调节作用。那么在心肌梗死中组蛋白乳酸化又具有什么作用呢？

　　近日，哈尔滨医科大学附属第二医院心内科于波、张毛毛、吴健教授课题组在Circulation Research (IF=23.213)上在线发表了题为“Histone Lactylation Boosts Reparative Gene Activation Post Myocardial Infarction”的研究论文，研究揭示组蛋白乳酸化可通过促进修复基因的转录来调节单核-巨噬细胞的抗炎和血管生成的双重活性，促进单核细胞修复转录的早期远程激活。对心肌梗死后免疫稳态的建立、修复环境的形成和改善心肌梗死后的心脏功能以及及时激活心脏修复过程起到了重要作用。

　　

　　研究结果

　　1.心脏复张前骨髓和循环单核细胞中修复基因的早期和远程激活

　　分析不同时间点的心肌梗死小鼠的骨髓和循环单核细胞的单细胞RNA-seq测序数据发现细胞大致被定义为5个大的类群，7个组（图1A-1C）。GO分析显示单核细胞除了上调和放大心肌梗死后的炎症反应外，还迅速启动修复过程，包括对血管生成和伤口愈合的反应（图1D）。同时会启动一系列经典修复基因的表达，包括心肌梗死后早期的Anxa6、F10、Lrg1和Tgfbi（图1E）。心梗后单核细胞发育过程的拟时序分析表明，BM和循环单核细胞中的修复基因早期激活，并随着时间的推移逐渐积累（图1F和1G）。对假手术或第1天心肌梗死小鼠的循环单核细胞的RNA-seq数据进行分析，鉴定了心肌梗死后650个上调基因和203个下调基因，这表明循环单核细胞在到达受损心脏之前经历了早期和不同的转录组学变化（图1H）。GO富集分析证实，修复基因的表达，包括参与血管系统发育、伤口愈合和细胞外基质组织的基因，被广泛和远程激活（图1I）。在基于MCC方法的网络中具有最高优先级的10个基因中，修复基因Vegf-a和IL-10被鉴定为心梗后早期修复网络中的潜在中枢基因（图1J）。上述这些结果显示单核细胞在转录水平上修复活性会及时启动，并通过炎症和修复基因的早期精细调节实现对免疫环境的动态调节。

　　

　　2. 心肌梗死后骨髓和循环单核细胞中的组蛋白乳酸化迅速升高

　　为了探讨乳糖基化在心肌梗死后单核细胞修复基因的早期和远程激活中的作用，作者检测了心肌梗死早期骨髓细胞和循环单核细胞以及心脏浸润巨噬细胞中乳糖基的变化。Western印迹分析显示，与对照小鼠相比，心梗小鼠的骨髓细胞和循环单核细胞中的总乳酸化水平显著升高，并且在17kDa附近出现了一条主要的带，这可能代表组蛋白H3（图2A和2B）。免疫印迹实验显示在小鼠心梗后4-24小时内，不同时间点的单核细胞乳糖基化水平显著上调，并在72小时前保持高水平的乳糖基化。相反，乙酰化水平在早期增加，并在MI后72小时内迅速下降至基线水平（图2C至2F）。作者检测了先前鉴定的组蛋白H3K18乳酸化（H3K18la）的水平，其显示出与总体乳酸化水平相似的趋势（图2G至2J）。且H3K18la水平维持在高水平达7天，并在心梗后14天恢复到基线水平。与此一致，心梗后3天梗死心脏的免疫荧光染色显示，整体乳糖基化和H3K18la水平显著升高，激光共聚焦图像显示乳糖基在梗死区域巨噬细胞的细胞核中定位（图2K和2L）。

　　这些数据表明，心肌梗死后梗死心脏局部和远端外围的单核细胞巨噬细胞表现出组蛋白乳酸化增加。

　　

　　3.组蛋白乳酸化促进心肌梗死后修复基因Lrg1、Vegf-a和IL-10的激活

　　为了筛选心梗中组蛋白乳酸化的候选靶基因，研究者使用H3K18la或抗H3K18la抗体对心梗后24小时的假手术小鼠和心梗小鼠中分选的循环单核细胞进行CUT&Tag测定。数据显示，H3K18la在基因的启动子区和上游区富集（图3A）。H3K17la修饰相关基因与心梗后的H3K18 ac显著不同。这些基因中只有14%（4168个基因中的566个）显示H3K18la和H3K118ac显著增加，而63%的H3K19la标记基因未显示H3K18ac的明显增加（图3B和3C）。

　　此外，基因集富集分析表明，H3K18la结合的基因在很大程度上与血管生成和伤口愈合有关（图3D）。为了鉴定心梗后单核细胞中H3K18la的靶基因，作者结合CUT&Tag和RNA-seq数据，根据基因的表达和H3K118la修饰将基因分为4类：上调基因有或无差异H3K17la，下调基因有或没有差异H3K18la（图3E）。通过对两类H3K18la修饰基因的从头基序搜索，作者发现H3K118la的上调和下调基因具有不同的富集DNA序列（图3F）。GO分析显示，心梗期间H3K18la修饰增加的上调基因参与血管生成的正调控（图3G）。

　　RNAseq数据的热图地表明，参与血管生成过程的许多代表性基因（如Vegf-a、Lrg1和IL-10，它们也是H3K18la修饰升高的基因）在心梗后显著上调（图3H）。筛选具有上调的H3K18la修饰的前30个基因，并根据转录上调进行排序；Lrg1是最显著上调的（图3I）。因此，作者将Vegf-a、IL-10和Lrg1作为乳糖基化的潜在靶基因（图3J）。RT-qPCR和ChIP-qPCR分析表明Vegf-a、IL-10和Lrg1启动子区中的表达增加和H3K18la富集相关（图3K和3L）。

　　

　　4. H3K18la调节巨噬细胞靶基因的转录和修复活性

　　为了研究H3K18la对修复基因表达的直接影响，作者通过添加外源乳酸盐或乳酸脱氢酶抑制剂FX-11处理细胞来控制骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）中的组蛋白乳酸化水平。用脂多糖（LPS）刺激BMDMs导致H3K18la水平升高（图4A）。添加外源性乳酸盐后，细胞内乳酸盐水平和组蛋白H3K18la水平升高（图4B和4C）。ChIP qPCR表明靶基因启动子区H3K18la富集增加，RT-qPCR结果证实了乳酸处理后靶基因表达上调（图4D和4E）。同时，FX-11显著抑制BMDM中的细胞内乳酸和H3K18la水平（图4F和4G）。ChIP qPCR和RT-qPCR表明FX-11治疗后H3K18la强度和靶基因表达降低（图4H和4I）。

　　乳酸盐处理组的促炎M1巨噬细胞的百分比显著降低，而FX-11处理组促炎M1巨噬细胞的百分比则升高（图4J和4K）。用乳酸盐处理的BMDMs的条件培养基与小鼠主动脉内皮细胞增殖增加（图4L）并且迁移到小室或伤口区域（图4M和4N）以及形成更有组织的分支和更长的管长度（图4O）有关，表明H3K18la升高的单核细胞具有增强的内皮细胞管形成能力。总之，这些数据表明H3K18la促进Lrg1、Vegf-a和IL-10的转录，并改善BMDM的抗炎和促血管生成双重修复活性。

　　

　　5.组蛋白乳酸化升高有利于修复环境并改善心肌梗死后的心脏功能

　　图5A显示了乳酸钠治疗心梗小鼠的实验方案。循环单核细胞和浸润巨噬细胞中的H3K18la水平显著升高（图5B和5C），乳酸钠处理的小鼠中Lrg1、Vegf-a和IL-10的mRNA水平升高（图6D）。乳酸钠治疗后H3K18la的增加抑制了炎性细胞因子IL-6和TNF-α（肿瘤坏死因子）的表达（图5E）。升高的H3K18la抑制Ly6Chi炎性巨噬细胞和中性粒细胞浸润（图5F和5G）。苏木精和伊红染色证实，H3K18la增加导致炎性细胞浸润减少（图5H）。CD31和α-SMA（α-平滑肌肌动蛋白）的免疫荧光染色表明，乳酸钠诱导的H3K18la增加促进了MI后的血管生成（图5I，5J）。Masson三色染色显示，乳酸钠诱导的H3K18la增加抑制了过度的心肌纤维化和病理性心脏重塑（图5K）。与对照组相比，H3K18la的增加改善了心梗后的射血分数和缩短分数，表明H3K18la除了其抗炎和促血管生成作用外，还改善了心梗后的心脏功能障碍（图5L至5N）。

　　总之，这些结果表明，心肌梗死后早期单核细胞巨噬细胞的组蛋白乳酸化增强有利于修复环境，有助于改善心肌梗死后的心脏功能。

　　

　　6.心肌梗死后循环单核细胞内源性糖酵解重编程部分增加H3K18la的水平

　　研究表明，巨噬细胞糖酵解通过提供乳酸作为底物来调节组蛋白乳酸化。然而，心肌复张前单核细胞的代谢转变及其在心肌梗死后调节乳糖化水平中的作用仍不清楚。因此，本文研究结果表明心肌梗死小鼠单核细胞糖酵代谢能力提高，基础氧化磷酸化和备用呼吸能力降低，最大呼吸强烈降低，这意味着外周单核细胞更强烈地依赖于糖酵解，而不是心梗后的氧化代谢（图6A至6D）。这些数据表明，单核细胞在MI后经历代谢重编程，这可能对依赖糖酵解的组蛋白乳酸化至关重要。

　　为了验证细胞内代谢模式和细胞外代谢产物对乳酰化和乳酰化相关基因表达的调节，作者使用二氯乙酸钠（DCA，丙酮酸脱氢酶激酶抑制剂）和鱼藤酮（线粒体呼吸链复合物I的抑制剂）调节参与糖酵解途径和线粒体呼吸链的关键酶的活性（图6E）。用鱼藤酮处理24小时后，BMDM中的细胞内乳酸和H3K18la水平显著升高，而在乳酸脱氢酶抑制剂FX-11的存在下则降低（图6F和6G）。

　　ChIP-qPCR和RT qPCR结果表明，鱼藤酮显著增加了乳酰化修饰和乳酰化靶基因Lrg1、Vegf-a和IL-10的表达（图6H和6I）。相反，DCA处理后，BMDMs的细胞内乳酸和H3K18la水平降低。向DCA处理的细胞中重新添加乳酸盐成功地恢复了细胞内乳酸盐、组蛋白乳酸化水平和H3K18la修饰基因的表达（图6J至6M）。为了进一步验证细胞外乳酸盐在组蛋白乳酸化中的作用，使用了乳酸盐转运蛋白MCT1（单羧酸转运蛋白1）抑制剂AZD-3965。外源乳酸盐的添加显著增加了BMDM中的组蛋白乳化水平和靶基因表达，而MCT1抑制显著抑制了外源乳酸盐、，这表明细胞外环境中的乳酸盐需要至少部分通过MCT1运输到细胞中，然后才能参与乳酸化（图6N至6P）。

　　

　　研究结论

　　本研究首先确了心肌梗死后小鼠的骨髓和循环单核细胞中的修复基因早期激活，而且发现两种细胞中的组蛋白乳酸化会迅速升高，而组蛋白乳酸化的升高促进心肌梗死后修复基因如Lrg1、Vegf-a和IL-10的激活。证明了H3K18la调节巨噬细胞靶基因的转录和修复活性，组蛋白乳酸化升高有利于修复环境并改善心肌梗死后的心脏功能，还证明了心肌梗死后循环单核细胞的H3K18la的水平增加部分是由内源性糖酵解重编程导致的。

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