揭秘蛋白互作的全过程！

　　工欲善其事必先利其器，也许您此时还在为纯化富集靶蛋白没有一个好的抗体偶联Beads而发愁，也许您此时收集的蛋白含量少，也许您此时富集的蛋白杂质含量多，也许您此时历尽艰辛收获的蛋白活力却降低了，也许您现在用的Beads操作步骤冗长，花费时间多，也许，也许……

　　下面，给大家来一次蛋白实验的盛宴：揭秘蛋白互作的全过程，IP和Co-IP究竟是一个怎样的神奇操作？

　　一、免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)

　　“免疫沉淀”一般是指采用固定在固相支持物上的结合蛋白，进行小规模的蛋白质亲和纯化的实验。更确切地说，IP是采用固定在微珠支持物(一般是琼脂糖树脂)上的特定抗体，从复杂的混合物中，纯化氮-抗原的实验。固定化蛋白质复合物的组装既可以分步进行，也可以一步完成(图1)。常见的加样顺序：抗体和样本(如细胞裂解物)一起孵育，然后加入亲和微珠，用于捕获抗体-抗原复合物。也可以将抗体和微珠(通过抗体结合蛋白，如蛋白A、G或AG等，直接或间接结合抗体)先进行孵育，然后再加入含有抗原的样本。当抗原、抗体和固相支持物产生结合以后，充分洗涤微珠，再采用适当的洗脱缓冲液从支持物上洗脱抗原。

　　二、免疫共沉淀Co-IP

　　免疫共沉淀分析(Co-IP)与IP十分类似，基本的技术都是采用目标抗原特异性的固相化抗体；但IP的目标是纯化单一抗原，而Co-IP旨在分离抗原及与抗原结合的蛋白质或配体。在Co-IP实验中，因子抗原称为诱饵蛋白，与之结合的蛋白则称为靶蛋白。靶蛋白可能是一些复杂的伴侣蛋白、信号分子、结构蛋白、辅助因子等，蛋白间相互作用强度范围可能介于高度瞬时和十分稳定之间。基本的Co-IP实验方案与IP相同，实际上任何IP系统均可用于Co-IP。但是，还有许多其他因素需要考虑，例如，结合和洗涤条件的优化，优化时，需要考虑到诱饵蛋白-靶蛋白的相互作用强度以及抗体-诱饵蛋白的亲和力。

　　三、Co-IP流程

　　样品准备

　　蛋白抽提：加入适量含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上裂解30 min后，于4°C，13000 rpm条件下，离心30 min，取上清，即为总蛋白样品。

　　体系孵育

　　体系洗涤

　　WB检测

　　Co-IP的注意事项和优缺点

　　温和的裂解条件

　　使用明确的抗体

　　使用对照抗体

　　Co-IP实验缺点：

　　可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体。所以，若预测不正确，实验就得不到结果。

　　Co-IP实验优点：

　　相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；蛋白的相互作用是在自然混合蛋白状态下进行的，可以避免人为的影响；可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

　　Co-IP和IP区别：

　　Co-IP：研究的是体内自然状态下的蛋白质互相作用，不能显示蛋白质之间的相互作用是直接还是间接的。

　　IP：根据抗原和抗体的特异性结合，利用抗体将靶标蛋白分离或纯化，检测某一种蛋白的表达情况。