洪观杰析｜带你入抗体药行业（2）——浅谈抗体药靶点和结构选择

　　以下文章来源于生物药大时代 ，作者cpu随风而逝

　　上一期简单介绍了抗体的结构与功能，原计划本期讲终分子的获得流程，但听到有些刚入行的朋友对大小分子的靶点问题不太理解，为了更系统的讲解，本章决定先从抗体药的最重要也是最原点的靶点开始谈起，简要介绍下抗体药物针对的靶点分类和结构选择。

　　自1986年FDA批准第一款抗体药OKT3，2021年4月随着葛兰素史克 PD-1 抑制剂 dostarlimab 的批准，抗体药物达到了 100 个，进入了「百抗」新时代，销售额预计2025年将达到3000亿美元。而类型也从全长单抗（IgG1、IgG2、IgG4）开发出双特异性抗体、ADC、抗体片段（Fab、单链抗体、纳米抗体）

　　

　　图1 抗体药重大发现年鉴

　　同样抗体针对的靶点和治疗领域呈现百家争鸣状态，癌症、皮肤科、血液病、心血管、抗感染等均有抗体药获批上市。

　　

　　图2 100个上市抗体药治疗领域分布

　　

　　图3 100个上市药治疗领域分布—摘自《2021年全球抗体药物市场研究报告》

　　大家都知道，抗体目前主要针对细胞膜或细胞外的物质，小分子可针对细胞内和细胞外的物质。

　　01

　　为何抗体目前主要针对细胞膜或细胞外的物质？

　　1.1. 抗体是一类分子量较大的蛋白质（天然单抗>145kD，重链抗体（骆驼抗体）>80kD，最小的纳米抗体仍有15kD，远超小分子），亲水性较强，脂溶性差，因而通过细胞膜是有一定难度的，单抗药物从血液循环进入组织的比例约为5%-15%，大脑的分布比例则相对更低。另外即使机体本身存在内吞、吞噬等作用，可以把抗体带到细胞内，胞内的溶酶体和蛋白水解酶也会将其降解。（此机理正是ADC药物行驶功能的原理，但ADC药物的抗体针对的靶点仍是细胞膜上的蛋白，ADC上的小分子才是针对胞内物质）

　　1.2. 但这也不意味不能，也有学者正在研究用囊泡把抗体送入细胞内发挥作用（如图4所示），但目前还在研究。

　　

　　图 4 囊泡将抗体送入细胞示意图

　　02

　　抗体针对的物质是哪些？

　　2.1. 细胞外的物质：主要包括细胞因子、细菌、病毒、抗体等。针对此物质的我们常为中和抗体，

　　2.1.1. 细胞因子。一个比较典型的靶点为肿瘤坏死因子-α（TNF-α），诞生了多个重磅炸弹英夫利西单抗（Influximab）、戈利木单抗（Golimumab） 、依那西普（Entanercept）和阿达木单抗（Adalimumab）、培塞利珠单抗（Cortolizumab Pegol）等。

　　2.1.1.1. 首先介绍下配体和受体， 如图所示TNF-α以17 kD分泌型(sTNF-α)和26 kD跨膜型(tmTNF-α)二种形式存在。tmTNF-α是sTNF-α的前体，sTNF-α可与细胞膜上的受体TNFR1或TNFR2结合，从而激活各类下游的信号通路，一方面起到抵抗感染和抗肿瘤，另一方面易引起炎症并发症，研究表明TNF-α分泌过多及错误攻击是诱发类风湿性关节炎、强制性脊柱炎等炎症相关疾病的主要原因。在这个体系下，sTNF-α是配体，而TNFR是受体。

　　

　　图 5 TNF-α作用机理图

　　2.1.1.2. 为了阻断结合，有两种思路，一种是封闭TNF-α。另一种是封闭TNFR（此属于跨膜蛋白，会在下一节小结细讲）。封闭TNF-α同样有两种思路如下图，

　　一种采用抗体，如英夫利昔（Infliximab人鼠嵌合单抗）、阿达木（Adalimumab全人源单抗）、戈利木(Golmumab、全人源单抗)、培塞利珠（Certolizumab pegol，Fab片段），其Fab区域可特异性与TNF-α阻断其与TNFR的结合。前三者为全长抗体，含有Fc区域，其可介导Fc相关功能，益处是其与tmTNF-α结合通过ADCC等效应清除细胞；但也考虑到Fc介导的ADCC等可促进炎症，优时比制药去掉了Fc区域，只保留化抗原结合片段Fab，同时为了提高半衰期，进行了PEG修饰得到了培塞利珠单抗。

　　另一种则是通过受体，依那西普则是人TNFR2的可溶胞外域与Fc片段融合，前者可特异性结合sTNF，Fc区域可延长半衰期同时发挥其他Fc功能。（这几种药物中哪种药物更好? 作者不专业，仅简要概述，可查看其他临床疗效文章！）

　　

　　图 6 五种主要的TNF-α生物抑制剂

　　2.1.2. 细菌、病毒。如近日获批的国内首个上市的新冠病毒中和抗体联合疗法，即安巴韦单抗/罗米司韦单抗联合疗法。其机理是

　　

　　图 7新冠病毒侵染过程和中和抗体发挥作用示意图

　　新冠病毒通过刺突蛋白（S蛋白）与人体细胞的表面受体——血管紧张素转化酶2（ACE2）结合，随后病毒被内化进入细胞，在细胞内被转录酶复制，重新组装成大量新的病毒，又去继续感染其他细胞

　　通过筛选获得能特异性靶向新冠病毒S刺突蛋白的中和抗体，阻止S刺突蛋白与细胞上的ACE2受体结合的关键蛋白域），通过阻断它们之间的相互作用可以防止新冠病毒感染人体细胞，并将病毒从体内清除。

　　2.1.3.抗体，一个典型的靶点为IgE。如下图所示，接触过敏源后，浆细胞产生的IgE抗体，其与效应细胞上IgE高亲和力受体（FcεRI）的结合，释放组胺、白三烯及其他炎症介质。因而在这个疾病中，过敏原无法避免的情况下，IgE是罪魁祸首。那科学家就把IgE当做目标抗原，制备得到了抗IgE的抗体如奥马珠单抗，最主要作用是阻断游离的IgE与FcεRI结合，同时也下调肥大细胞等表面FcεRI受体的表达，得以治疗哮喘、荨麻疹等疾病。

　　

　　图 8 哮喘发生机理及奥马珠单抗作用示意图

　　2.2.细胞膜上的物质：一般为跨膜蛋白，如图展示的是几种不同类型的跨膜蛋白

　　

　　图9 跨膜蛋白结构

　　按类型可分为(A)α-螺旋蛋白和β-桶膜蛋白的结构；

　　按次数分为单次和多次，

　　按蛋白形式G蛋白偶联受体(GPCRs)，离子通道，转运体，受体。

　　按细胞功能分，又可以成为靶细胞上的物质，如肿瘤相关抗原（TAA）或肿瘤特异性抗原（TSA）；效应细胞上的物质，如T细胞上表达的PD-1、CD3等。

　　针对细胞膜上的蛋白，按抗体发挥功能上大致可分为三类

　　抗体结合膜蛋白，发挥中和和阻断作用；

　　抗体结合膜蛋白，发挥抗体介导的杀伤作用

　　抗体结合膜蛋白，引起膜蛋白变构激活下游通路。

　　2.2.1.  结合膜蛋白，发挥中和和阻断作用；

　　

　　图10 TNFR1 结构域,左侧为N端胞外域（与配体等结合），TMD为跨膜区，右侧为C端胞内区（传导胞内信号）

　　上面提到TNF通过结合和激活两种不同受体TNFR1和TNFR2发挥作用。TNFR1广泛表达，并被可溶性和膜相关的TNF激活。TNFR1主要促进TNF诱导的炎症反应，因而近期也有公司正在开发抗体药物与TNFR1结合，阻断其与TNF-α结合，如Baliopharm  ATROSAB，其Fab区特异性与TNFR1结合，Fc区域经过改造，大大降低的Fc区介导ADCC和CDC等效应（此作用为杀伤各类细胞），减少促炎现象。近期Baliopharm 在ATROSAB基础上开发缺少Fc区域的Atrosimab。

　　（TNFR2表达仅限于特定的细胞类型，如免疫细胞、神经元和内皮细胞，并主要由膜相关的TNF激活。TNFR2维持局部免疫稳态。近期有多家公司针对TNFR2抑制剂能够特异性抑制在肿瘤微环境中高表达TNFR2的Treg细胞增殖，同时特异性杀伤肿瘤细胞，用于抗肿瘤治疗。相反凭借TNFR2高表达于Treg细胞的特点，针对自身免疫病，TNFR2激活剂可进一步活化Treg细胞，抑制Teff细胞（效应T细胞，Effector T Cells），下调免疫细胞的过度活化）

　　2.2.2. 抗体结合膜蛋白，发挥抗体介导的杀伤作用：

　　

　　图 11 CD20抗体发挥作用示意图

　　以经典CD20为例，CD20抗原是一种B细胞分化抗原，仅位于前B细胞和成熟B细胞，它在95%以上的B细胞性淋巴瘤中表达，而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织中不表达（肿瘤相关抗原TAA）。

　　因而它可以作为淋巴瘤特异性的靶点，抗体特异性结合到肿瘤细胞上的CD20的胞外域，一方面其阻断作用，更重要的是Fc区域能随之抗体依赖的细介导的细胞毒作用（ADCC），补体依赖的细胞毒作用（CDC），抗体依赖的细胞介导的吞噬作用（ADCP）及程序性细胞死亡（也称为直接细胞死亡或凋亡，PCD）诱导靶细胞死亡。

　　发挥功能需要Fc介导的功能，因而在抗体结构选择时一般选择全长且有较强Fc功能的IgG1型，此外通过糖基化改造，增强ADCC作用等，如三代药物ubilituximab、Obinutuzumab（奥滨尤妥珠单抗、Gazyva）。同时，不同的抗体识别的表位也不同，亲和力、构象等因素，也会导致最终功能不同。

　　

　　图12  CD20结构示意图及各CD20抗体结合区域示意图

　　Her2、Trop2、CD22、CD33、BCMA、Claudin 18.2等均属于此列，肿瘤细胞上高表达抗原，这也是这些靶点可以作为ADC药物靶点的原因。

　　2.2.3. 免疫抑制和免疫激活相关膜蛋白。

　　2.2.3.1.  抗体结合膜蛋白，引起膜蛋白变构激活下游通路：

　　最为经典也是目前最常用的是T细胞表面的CD3，1986年第一个被FDA批准上市的单抗药物就是CD3ε的单抗Muromonab。CD3抗原作为T细胞表面的重要标志，是由四条蛋白链（CD3γ、 CD3δ 、CD3ε、CD3ζ）组成的蛋白复合物结构。T淋巴细胞活化是免疫应答的基础，T淋巴细胞活化需要双信号的刺激。第一信号为特异性抗原识别信号，即APC表面的MHC-抗原肽复合物和TCR-CD3复合物结合，将刺激信号传入细胞内，第二信号为协同刺激信号，即APC表面协同刺激分子和T细胞表面系统刺激分子如CD8等结合。

　　

　　图 13 CD3和TCR复合体及抗原提呈示意图

　　如图13所示，TCR的αβ亚基主要识别MHC分子呈递的抗原，但胞内区非常短，需要和CD3形成TCR-CD3复合物才能将刺激信号传入细胞内，CD3蛋白含有3对二聚体（εγ、εδ、ζζ），由四种亚基组成，他们胞内区均含有免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM）。ITAM是启动信号级联反应所必需的，因为它们募集蛋白酪氨酸激酶，信号转导中间体和衔接分子。

　　 如图14所示，CD3的抗体OKT3 Fab区域与CD3εγ结合后引起其构象改变，可在没有TCR聚集或交联情况下，诱导Nck蛋白募集到CD3ε链细胞质尾部来启动信号传导的级联反应，激活后续的免疫反应。基于上述机制。CD28、4-1BB等免疫激活型靶点，同理类似。

　　

　　图14  OKT3结合CD3ε亚基导致构象改变激活下游信号示意图

　　但是但是，OKT3 实际上是获批的应用于治疗神移植后的急性排斥！这里主要与抗体结构有关。OKT3是全长的鼠源抗体，有免疫原性和丝裂原性，Fc区域可介导ADCCCDC等清除作用，同时导致TCR表达的下调。诱导调节性T细胞Treg的激活等。CD3是T细胞均表达的受体，所以靶向CD3也会引起T细胞的一些反应。

　　目前火热的T细胞链接器的开发方向，主要是应发挥拉进T细胞与肿瘤细胞距离，及介导激活效应，减少T细胞清除等负作用，抗体结构得选择较为关键，上市的治疗白血病和淋巴瘤的Blinatumomab（同时靶向CD3和CD19的双特异性抗体），采用ScFv的单链抗体，去除Fc区域，一方面是分子量小，有较强的穿透力，另一方面会减少Fc区域导致的T细胞清除（个人理解， 个人想法是否可以用Fc改造，去除ADCC等效应，保留FcRn的结合，保证半衰期的同时不产生额外副作用）

　　

　　图15  Blinatumomab构建原理和作用机理（由CD3和CD19两个单链抗体scfv共价链接而成，一端链接T细胞上的CD3激活T细胞，一端链接肿瘤细胞的CD19蛋白，拉进T细胞和肿瘤细胞）

　　2.2.4.  讲完激活剂，最后再介绍下免疫检查点抑制剂。以最经典为PD-1/PD-L1为例。如下图所示，肿瘤细胞表达PD-L1，与T细胞表面的PD-1结合，导致TCR即使识别了肿瘤抗原，仍无法进行杀伤，产生了逃逸。因而需要引入抗体进行阻断，同2.2.1。阻断方式有两种，PD-1的抗体和PD-L1的抗体。这两种抗体是否有区别？

　　

　　图16 PD-1/PD-L1抑制剂发挥作用示意图

　　

　　 

　　

　　图17 PD-1/PD-L1轴相关配体受体示意图

　　图17 所示，描述了PD-1与PD-L1轴相关配体，由于配体不同，抗体发挥的作用和不良反应差异很大。

　　PD-1抗体同时阻断了PD-1和PD-L1、PD-L2的结合，会促进PD-L2与受体RGMB结合增加，其可能会促进免疫细胞过渡活化，导致呼吸免疫耐受降低，增加肺炎的发生率。

　　PD-L2的抗体同时阻断了PD-L1和PD-1和CD80的结合，保留了PD-1/PD-L2的结合通路，维持就是细胞PD-L2的局部稳态，减少相关不良反应的发生，另会促进CD80与CD28的结合，激活免疫系统。

　　

　　图 18  PD-1及PD-L1抑制剂阻断不同配体作用示意图

　　此外由于表达细胞不同，抗体的设计理念是完全不同的，大家可看到市面上针对PD-1的抗体大多属于IgG4亚型，或者Fc功能沉默的IgG1，出发点是IgG4的Fc功能较弱，避免T细胞耗竭问题，更主要是发挥阻断作用；

　　针对PD-L1的大多是IgG1亚型，而IgG1的结构稳定性最佳，存在Fc功能也可一定程度上介导消除肿瘤细胞，如上市的Avelumab是存在ADCC效应，因而PD-L1的抗体除了阻断作用后，还发挥Fc介导杀伤。

　　至此简要介绍了抗体作用的不同靶点分类及抗体所起到的作用，希望各位读者对抗体靶点有个初步的认识。上述主要以单抗举例，目前双抗/多抗如火如荼，双抗同时结合两个靶点或同一靶点的不同表位，常常具有联合用药无法实现的效果，但有时副作用也可能会加剧，因而要仔细研究机理。

　　此外人体免疫系统是个非常复杂的体系，有众多代偿途径，众多疾病的发生发展，肿瘤的免疫逃逸等诸多谜团仍未破解，所使用的抗体也并非如上述描述如此智能只会与病患处结合，它也会与其他区域的特定蛋白发生特异或非特异性的结合，导致众多不良反应产生。此外各体差异很大，当时被予以厚望的PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂响应率仅约30%，多数实体瘤患者的生存率仍较低，仍有太多未被满足的临床需求，靶点发掘及其机制研究亟待解决，制药之路道阻且长啊。