Blood ｜ 通过多组学亚克隆分析解决多发性骨髓瘤的治疗抗性机制

　　原创 云里有星 图灵基因 2023-07-16 10:13 发表于上海

　　撰文：云里有星IF=25.476推荐度：?????亮点： 1、含在各种亚克隆间预存在的表观遗传谱和趋集适应模式的耐药机制的平行发生。2、亚克隆特异的骨髓瘤和骨髓微环境细胞间的相互作用。

　　近日，德国海德堡大学医院的Marc S. Raab 等人团队在《Blood》杂志上发表了名为“Resolving therapy resistance mechanisms in multiple myeloma by multi‐omics subclone analysis”的文章。肿瘤内异质性往往随具有多种药物抗性的亚克隆累积在多线治疗后变得最为明显。为解决这一挑战，在亚克隆水平表征抗性的机制是辨别常见缺陷的关键。本文中，作者为定义由15例复发/难治性骨髓瘤(RRMM)组成的纵向样本的亚克隆结构和进化整合了全基因组测序、单细胞转录组学(scRNA‐seq)和染色质可及性(scATAC‐seq)以及线粒体DNA(mtDNA)突变。作者评估了转录组和表观组的变化以解决治疗抗性的多因素本征，并将其与不同机制的伴行发生联系起来：(i)与生存优势相关的预先存在的亚克隆表观遗传谱，(ii)遗传学显著不同的亚克隆的趋集表型适应，和(iii)亚克隆特异的骨髓瘤和骨髓微环境细胞间的相互作用，展示了综合多组学分析如何用于随时间追踪和表征显著不同的的抗性克隆，以识别针对其的分子靶标。

　　瘤内异质性与其在治疗中的适应和进化是治疗抵抗的主要来源，范例疾病是多发性骨髓瘤(MM)，特点为骨髓(BM)中恶性浆细胞的克隆扩增。各种耐药机制积聚时，MM的瘤内异质性是一个在多线治疗过程中变得最明显的临床挑战。随着为严重预治疗的复发/难治性MM (RRMM)近期引入了新型靶向免疫治疗，识别不同的抗多药的亚克隆的常见缺陷成为该领域迫切的未被满足的需求。

　　为实现这一目标，MM亚克隆已由来自拷贝数变异(CNAs)分析的单细胞RNA测序(scRNA - seq)和转录聚类定义。此外，选自单细胞染色体可及性(scATAC‐seq)数据的线粒体DNA突变已被用于剖析和追踪其他血液系恶性肿瘤的亚克隆。同时，基因组、转录组或表观遗传学测序结果揭示了主导MM治疗反应的分子机制。 此外，scRNA-seq方法提供了MM细胞和已被证实在疾病表型中必不可少的骨髓微环境(BME)相互作用的信息。然而，除了这些进展，解决多因素的治疗抗性性质仍然具有挑挑战性。近期研究基于基于单个读数定义亚克隆，因此聚焦于分子抗性的个体角度。同样地，在何程度上不同的抗性机制会一同出现在同样的亚克隆中并在治疗中变化仍不清楚。

　　先前研究强调了MM的治疗相关的亚克隆动力学。然而，个体亚克隆对治疗的反应和与BME的相互作用在很大程度上仍属未知，尽管可为治疗耐药机制提供重要信息。因此，作者对15例RRMM患者的CD138+分选骨髓抽液进行了联合WGS的基于液滴的scATAC-seq和scRNA-seq。为12/15例患者在挽救治疗前(T1)和随后复发时收集序列样本，产生44,637和37,280个肿瘤细胞，行以上测序。随克隆和亚克隆CNAs出现在几乎所有MM患者中，作者进行了WGS引导的聚类策略以解析前述测序数据中的亚克隆结构。两种sc-seq模式获得的结果高度相关，从而将单个亚克隆的转录和表观遗传谱结合起来。

　　作者的最初方法是基于具有相同CNA谱的MM细胞属于同一亚克隆的假设。接下来，作者探究了在MM中是否mtDNA突变可进一步剖析基于CNA的亚克隆的定义，因它们最近被提出能作为研究慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性髓系白血病(AML)的克隆动力学的可选方法。因此，作者在scATAC-seq数据中调用mtDNA突变，并在匹配的WGS中确认了各自变体的丰度。总体上，每个RRMM患者显示出与众不同的mtDNA突变谱(平均=6个突变，范围1 - 14个突变)。与先前的报道一致，突变遵循等同于C>T和T>C的选择中性和复制不对称模式。

　　对于患者RRMM19，和为了体细胞核突变的基于WGS的癌症克隆分数(CCF)，两个mtDNA突变(15777G>A和3749T>C)分别在T1和T2的单细胞中显著不经比较同地富集，支持两个具有相同CNA谱的亚克隆，并进一步表明在MM中存在亚克隆定义的mtDNA突变。因此，作者接下来单独比较了由mtDNA突变和最初基于CNA的评估定义的亚克隆。独特的mtDNA被检测于33%的CNA定义亚克隆(18/55)，表明仅mtDNA突变不足以解析RRMM的亚克隆结构。

　　通过结合CNAs和mtDNA突变，作者得以揭示亚克隆结构的进一步细节。患者RRMM15是这一发现的主要例子。该患者中，作者最初仅使用WGS引导的CNA方法鉴定了9个亚克隆。通过整合mtDNA突变信息，作者在scATA-seq数据中确定了另两个亚克隆。这两个亚克隆通过scATAC-seq中两个世系定义mtDNA突变10114T>C和14769A>G(分支A)来区分，并分别在染色体1p和16q上描绘了独特缺失。重要的是，这些最初未检测到的CNAs也可以在测序数据中被分配到相应亚克隆。此外，作者检测到在多个亚克隆中共同富集的mtDNA突变，这些突变同样标记了亚克隆分支(例：亚克隆1和2中的15928G>A，亚克隆7和8中的15356G>A和12962G>A，亚克隆9、10和11中的13958G>A)，并使作者描绘克隆关系。携带着这些共同富集mtDNA突变的细胞在UMAP图上隔离并标记了含为POUF5F1B,TCF3和IRF4 TF模体的分支特异的活动的不同种群，支持这些亚克隆的密切关系。

　　接下来作者评估是否可通过mtDNA突变来追踪新出现的复发疾病，因此分析了来自在长达3899天的时间跨度内连续采样的6位患者为肿瘤样本的测序数据(图2h，补充图4a‐c)。在4/6例患者中检测到包括RRMM富集突变的动态mtDNA突变(RRMM2/9/10/15)。值得注意的是，在这些患者中，RRMM富集突变可在T2前2464天被看到，然而它们都不能在基线被测得，表明一线治疗或复发治疗时暴露于马法兰（溶肉瘤素左旋体，一种抗MM药）的单肿瘤细胞的克隆扩增。事实上，在研究中，所有具有RRMM富集mtDNA突变的患者都携带与暴露于马法兰密切相关的单碱基替换(SBS)-MM1突变特征。

　　综上，作者的结果描述了当与基于CNA的亚克隆分配相结合时，mtDNA突变如何能最好地被应用为谱系标记。这种综合方法产生了能有平均每个患者4个(范围：1‐11)亚克隆的亚克隆结构的全面图景，及匹配转录组和表观基因组谱。在有配对样本的患者中，分别有5例、4例和3例患者出现稳定进化、克隆选择和分支进化，为研究后续章节中治疗前后亚克隆的动态学提供基础。

　　确定了具有匹配转录和表观遗传谱的亚克隆后，作者接下来在具有呈现于时间点和被作者联合的基于CNA和mtDNA分配定义的多个可识别的亚克隆的病人中，研究了治疗对单个亚克隆的影响。在即使只在单细胞水平有分支进化患者中，作者也无法在T1检测到已新出现的亚克隆。因此，作者将重点放在具有稳定进化或克隆选择模式的患者上，以随时间变化比较亚克隆转录和表观遗传。

　　虽采用了异质治疗方案，但这些患者仍出现共同的模式。作者发现，大多数治疗引起的基因表达变化和TF基序活性在每个患者的亚克隆情况单个亚克隆中共享。这些趋同适应机制可以通过对已知两种治疗方法的抗性机制来说明：通过增加热休克蛋白(HSP) 表达的蛋白酶体抑制和通过NFKB通路上调的MEK/BRAF抑制。在患者RRMM7中，如HSP90AA1的，被认为是耐药驱动因子的几种HSPs在两个克隆中经卡非佐米治疗中均显著上调。与这一发现相一致的是，包括ZNF384、IRF1和MEF2家族成员的可结合上调的HSPs46的启动子的TF基序，在两个亚克隆中在治疗后显示出更高的活性。在使用MEK/BRAF抑制剂治疗的RRMM3中，在两个亚克隆均表现出NFKB通路基因的显著上调。这被两个亚克隆中NFKB基序对MEK/BRAF抑制活性的显著提高所证实。BRAF/MEK联合抑制已被证明可引起更多临床反应。

　　因此，我们分析了属于该治疗组的另一名患者，其克隆组成发生了重大变化(RRMM9)。与RRMM3类似，30% (11/37)MEK/BRAF抑制治疗后上调的基因是NFKB通路的部分，包括BCMA (TNFRSF17)51、CD79A48、49和BTG250。对于RRMM9，只有四分之一亚克隆在治疗后仍然可检测到。该亚克隆在T1时表现出所有亚克隆中最高的NFKB家族成员基序活性。因此，作者得出结论，独立于亚克隆组成，治疗抗性可通过所有亚克隆的趋同表型适应或预先存在的，不必需被治疗诱导的的表观遗传谱来介导，这强调了在单个亚克隆水平上评估MM的重要性，以及多组学分析对理解转录和表观遗传特征在治疗介导的耐药中的作用的功用。

　　基于观察到亚克隆组分可能是差异的治疗反应的基础，我们接下来考虑了其他亚克隆结构可见治疗诱导变化的患者。特别地，作者发现患者RRMM6的MCL-1抑制引起具有双等位基因TP53畸变的亚克隆的耗尽。为解决这种耗竭的分子机制，作者首先探索了靶点的潜在亚克隆改变。作者检测了两个主要亚克隆间(亚克隆1与亚克隆2)在MCL-1位点共可及性上的差异，然而，这些差异并未致显著的MCL-1表达变化。

　　作者接下来评估了是否TP53畸变直接影响对MCL-1诱导的细胞毒的细胞弱点。因此，将基因工程双等位基因TP53 del/mut (R175H)52、53和wt/wt AM-1细胞系体外暴露于不同剂量的MCL-1抑制剂。与RRMM6研究结果所表明的相反，双等位基因TP53 AMO-1细胞系与野生型细胞系相比较不敏感。因此，TP53的失活似乎并不是RRMM6中亚克隆1缺失的基础。

　　接下来，作者转向两个主要亚克隆之间的转录差异。在T1时两个主要亚克隆之间差异表达最高的基因覆盖了几个表面标记。其中，CD44已被报道是一个细胞粘附介导耐药(CAM - DR)的关键分子，且是肿瘤-BME相互作用的已知媒介。与差异基因表达分析一致，scATAC -seq数据的共可及性分析显示CD44启动子与亚克隆1的对亚克隆2在时间点T1缺失的远端推定增强子元件之间存在很强相关性。因此，激活一个亚克隆而不激活另一个亚克隆中的增强子可导致观察到的CD44表达的差异。为测试CD44高表达是否与双等位基因TP53失活有关，作者对46例RRMM患者进行了大部的RNA测序。

　　作者发现，与TP53野生型和TP53突变患者相比，CD44表达在TP53双等位基因突变患者显著增加。作为功能验证，作者转向来自基因工程双等位基因TP53 del/mut (R175H)和wt/wt AMO -1细胞系的公开的大量RNA-seq数据，发现具有未激活TP53的细胞的CD44基因表达较TP53wt细胞系明显更高，Western blot也证实这一发现。CD44在T1时的高表达随后在MCL-1抑制后下降，表明潜在的包括改变的亚克隆-BME相互作用的机制。事实上，CellChat在T1时通过CD44预测了亚克隆1与cDC2/ gmp /CD14+以及CD16+单核细胞之间的特异性相互作用。重要的是，这种各自的相互作用在MCL-1抑制时丢失。综上，这些结果表明在具有不同治疗反应的亚克隆之间，肿瘤-BME相互作用有差异。

　　上述发现使作者将互作预测扩展到每个时间点至少有两个共存亚克隆和匹配BME scRNA-seq的所有患者(n=7)。这些患者中，CellChat预测平均有32个肿瘤和BME细胞之间的、有约20%未在每个患者所有亚克隆中预测的配体受体相互作用(范围23 -45)。在患者队列中，细胞间粘附分子(ICAM)信号网络被发现介导了大多与BME的非共享相互作用。特别地，在5例患者中，骨髓瘤细胞上的ICAM2与BME细胞上的几种整合素(ITGB2/ITGAL/ITGAM/ITGAX)之间的相互作用被预测具有亚克隆特异性。

　　此外，所有有纵向样本的患者都显示在时间点之间变化的相互作用(时间的改变)。例如，在患者RRMM15中，T2时的所有亚克隆都显示出由ICAM1途径介导的时间相互作用，而在T1时未检测到。以ICAM1的单克隆抗体bersanlimab为形式的靶向ICAM-1免疫治疗或CD38 x ICAM1双特异性抗体已经在临床试验被测试(NCT01838369)，或已被建议用于MM和B细胞非霍奇金淋巴瘤。因此，作者在16例RRMM患者的扩展的主体RNA-seq数据集中进一步研究ICAM1的时间表达变化，发现ICAM1表达在T2时显著上调，特别是在患者RRMM6和RRMM15中。

　　为进一步描述ICAM1表达增加的机制，作者在测序数据中评估了ICAM1位点的染色质可及性。作者观察到在T2相较T1，细胞ICAM1启动子区域具有更高的共可及性，表明治疗诱导的更高ICAM1活性。此外，RRMM细胞在T2时也表现出更高的包括先前在MM发病机制中描述的包括IRF64-73、NFKB74-76和STAT77-79家族成员的TF基序的可及性。在这些家族中，IRF4、IRF1、RELA、STAT1和STAT2是已知的驱动ICAM1表达的TF。scATAC-seq数据得出的上调机制与有测序(ChIP - seq)分析的MM细胞系KMS12BM73的染色质免疫沉淀实验结果一致。作者发现ICAM1启动子峰与IRF4 ChIP-seq峰有重叠。这些正交数据集表明了由包括IRF4在内的TFs驱动的不同的ICAM1的表达。

　　

　　总体而言，作者观察到所有患者亚克隆特异的随治疗变化的与BME细胞的相互作用。一些相互作用，如由ICAM1介导者，在给定时间点上在亚克隆之间共享，因此代表了亚克隆间的潜在的可操作的免疫治疗靶点。

　　教授介绍

　　Prof. Dr. med. Marc-Steffen Raab，德国海德堡大学医院骨髓瘤中心临床负责人，血液肿瘤专家。 Marc-Steffen Raab团队主要关注多组学和免疫学层面改变对骨髓瘤预后和治疗的影响，探索新靶点和标志物。

　　参考文献Poos AM, et al. Resolving therapy resistance mechanisms in multiple myeloma by multi-omics subclone analysis. Blood. 2023 Jun 30:blood.2023019758. doi: 10.1182/blood.2023.019758. Epub ahead of print.>>>关于我们<<<

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