治疗与细胞内吞、外吐和内体转运相关的疾病的化合物的制作方法

　　1.本发明涉及治疗与细胞内吞、外吐和内体转运相关的疾病的化合物。背景技术：2.波形蛋白是一种中间丝蛋白，在正常的细胞过程，例如细胞的内吞、外吐 和胞内物质转运，及在多种疾病，例如感染性疾病和癌症的发生发展中起着重 要作用(danielsson,f.et al.，vimentin diversity in health and disease，cells 7:147；2018)。3.感染人类的病原体多种多样，其中包括细菌和病毒。针对特定病原体来寻 找有效药物是常规的药物开发策略。这种药物仅对特定病原体有效，对突变后 的该病原体或不同的病原体则无效。与仅对特定病原体有效的直接对抗病原体 的药物不同，针对宿主开发的药物则具有广谱的抗病原体作用。这种药物对劫 持相同细胞过程来传播的多种类型的病原体均有效。对所有的病原体来说，为 了成功感染细胞，首先必须进入细胞，然后在细胞内移动到合适的部位进行复 制，最终子代病原体从细胞中释出以完成感染周期。许多病原体劫持了相同的 细胞过程，例如通过细胞内吞进入细胞，通过内体转运到细胞内合适部位以完 成复制，通过外泌体途径释出子代病原体。4.使用上述细胞过程进行感染的病原体有很多，包括但不限于冠状病毒，艾 滋病毒，流感病毒，乙肝病毒，丙肝病毒，人乳头瘤病毒，埃博拉病毒，登革 热病毒，大肠杆菌，肠炎沙门氏菌，嗜吞噬细胞无形体，沙眼衣原体，化脓性 链球菌，结核分枝杆菌，鸟型分枝杆菌和痤疮丙酸杆菌等。5.癌症与细菌病毒感染是完全不同的疾病，但与病原体一样，癌细胞也利用 这些细胞过程为其生长和扩散服务。癌细胞依靠内吞来高效摄取营养 (commisso,c.et al.，macropinocytosis of protein is an amino acid supply routein ras-transformed cells，nature 497,633-637；2013)，依靠外吐释放外泌体来 营造适合癌细胞生长和转移所需的微环境(pegtel,d.m.,gould,s.j.，exosomes， annu.rev.biochem.88,487-514，2019；kalluri,r.,lebleu,v.s.，the biology, function,and biomedical applications of exosomes，science 367,eaau6977，2020)。6.针对不同病原体(无论其具体类型，变异体和突变株)以及针对癌症(无 论是何种细胞类型)，抑制包括内吞作用，内体运输和外泌体释放在内的细胞 过程都会有广谱的抑制效果。7.多种病原体均利用波形蛋白来实现有效感染(mak et al.，vimentin inbacterial infections，cells.5(2):18,2016)。波形蛋白在病毒感染期间具有多种作 用(zhang,et al.，the diverse roles and dynamic rearrangement of vimentin duringviral infection，j cell sci.134:jcs250597,2021)。病原体经常使用它来附着细胞 (du,et al.，cell surface vimentin is an attachment receptor for enterovirus 71，jvirol.88:5816–5833,2014)，进入细胞内(et al.，vimentin modulatesinfectious internalization of human papillomavirus 16pseudovirions，j virol. 91(16):e00307-17,2017)，在细胞内转运(wu,et al.，vimentin plays a role in therelease of the influenza a viral genome from endosomes，virology.497:41-52, 2016)，至合适部位复制(turkki,et al.，human enterovirus group b viruses relyon vimentin dynamics for efficient processing of viral nonstructural proteins，jvirol.94(2):e01393-19,2020)，最终释出子代病原体(bhattacharya,et al.， interaction between bluetongue virus outer capsid protein vp2 and vimentin isnecessary for virus egress，virol j.4:7,2007)。8.波形蛋白是癌症治疗的潜在靶标(strouhalova,k.et al.，vimentinintermediate filaments as potential target for cancer treatment，cancers(basel) 12,184,2020)，因为波形蛋白在一些细胞过程起着关键作用，例如上皮到间 质转化(emt)(liu,c.y et al.，vimentin contributes to epithelial-mesenchymaltransition cancer cell mechanics by mediating cytoskeletal organization and focaladhesion maturation，oncotarget 6,15966-15983,2015)，细胞迁移和侵袭 (sharma.p.et al.，intermediate filaments as effectors of cancer developmentand metastasis:a focus on keratins,vimentin,and nestin，cells 8:497,2019)。 这些都是所有实体瘤的共同特征，而不仅限于特定的肿瘤类型。技术实现要素：9.本发明第一方面提供下式a所示的均三嗪衍生物，或其药学上可接受的载 体、前药、对映异构体、非对映异构体、互变异构体或溶剂化物在制备治疗或 预防与细胞内吞、外吐和内体转运相关的疾病的药物中的用途：[0010][0011]式中：[0012]r1为氢、卤素、硝基、氨基、羟基、c1-c12烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷 氨基、二c1-c6烷氨基、羟甲基或胺甲基；[0013]r2为-nr4r5，r4和r5独立地选自氢、c1-c6烷基和c1-c6卤代烷基，或者 r4和r5与它们所连的氮原子一起形成任选含有另外的选自nr6、o和s的杂 原子的4至6元饱和或不饱和杂环，所述杂环可以被羟基、卤素、硝基、氨基 或c1-c6烷基取代，其中r6为氢、羟基、c1-c6烷基或c1-c6卤代烷基；[0014]z为任选被1-3个r3取代的芳基或杂芳基；优选地，所述芳基为6-14元 芳基，如苯基或萘基；所述杂芳基为5-10元杂芳基，优选为含氮杂芳基，包 括但不限于咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、吡咯基、三 唑基和四唑基；优选地，z为任选被1或2个r3取代的苯基或吡啶基；[0015]r3为氢、卤素、硝基、氨基、羟基、c1-c12烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷 氨基、二c1-c6烷氨基、羟甲基、胺甲基或-cora；[0016]ra为oh或nr7r8，r7和r8独立选自氢、任选被一个或多个选自卤素或 nr9r10的取代基取代的c1-c6烷基和被3-(c2-c6炔基)-3h-双吖丙啶基取代 的c1-c6烷基，或者r7和r8与它们所连的氮原子一起形成任选含有另外的选 自n、o和s的杂原子的任选被c1-c6烷基取代的4至6元杂环；[0017]r9和r10独立选自氢和c1-c6烷基，或者r9和r10与它们所连的氮原子一 起形成任选含有另外的选自n、o、s的杂原子的4至6元杂环；和[0018]x为nh或o，与苯基的间位或对位连接。[0019]本发明第二方面提供一种治疗或预防与细胞内吞、外吐和内体转运相关的 疾病的方法，所述方法包括给予需要的对象或个体治疗或预防有效量的本文式 a所示的均三嗪衍生物，或其药学上可接受的载体、前药、对映异构体、非对 映异构体、互变异构体或溶剂化物，或含有治疗或预防有效量的本文式a所示 的均三嗪衍生物，或其药学上可接受的载体、前药、对映异构体、非对映异构 体、互变异构体或溶剂化物的药物组合物。[0020]本发明第三方面提供用于治疗或预防与细胞内吞、外吐和内体转运相关的 疾病本文式a所示的均三嗪衍生物，或其药学上可接受的载体、前药、对映异 构体、非对映异构体、互变异构体或溶剂化物，或含有治疗或预防有效量的本 文式a所示的均三嗪衍生物，或其药学上可接受的载体、前药、对映异构体、 非对映异构体、互变异构体或溶剂化物的药物组合物。[0021]本文用于上述任一方面的方法和用途的式a化合物优选是下文任一实施 方案所述的化合物，尤其包括式i-1、i-2、i-3和a-1所述的化合物以及表格中 列出的各具体化合物。[0022]本文上述任一方面所述的与细胞内吞、外吐和内体转运相关的疾病为波形 蛋白介导的疾病，包括癌症、病原体感染、以及一个或多个细胞过程异常导致 发病的其它疾病。优选地，所述癌症具有以下特征：其癌症细胞利用波形蛋白 实现侵袭性生长，利用内吞摄取营养，利用外吐释放外泌体作为媒介与其它细 胞通讯，营造适合癌细胞生长和转移所需的微环境；优选地，所述癌症包括： 结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌、甲状腺癌、肝癌、肾癌、肺癌、前 列腺癌、肉瘤、胶质瘤、血病和多发性骨髓癌。[0023]本文上述任一方面所述的所述病原体是细菌和/或病毒，所述病原体通过 内吞作用进入细胞，通过内体途径在细胞内运输和/或通过外泌体途径从细胞中 释出子代；优选地，所述病原体选自：冠状病毒(包括sars-cov-2)，艾滋 病毒，流感病毒，乙肝病毒，丙肝病毒，人乳头瘤病毒，埃博拉病毒，登革热 病毒，大肠杆菌，肠炎沙门氏菌，嗜吞噬细胞无形体，沙眼衣原体，化脓性链 球菌，结核分枝杆菌，鸟型分枝杆菌和痤疮丙酸杆菌中的一种或多种；优选地， 所述病原体感染为这些病原体中的一种或多种病原体引起的感染；优选地，所 述病原体感染引起的疾病为传染性疾病或感染性疾病，包括但不限于新型冠状 病毒肺炎，艾滋病，乙型肝炎，流行性感冒，黏附侵入性大肠杆菌(aiec) 感染。附图说明[0024]图1：与波形蛋白结合的均三嗪衍生物，例如c50，会改变细胞内波形蛋 白的分布和可流动性。a：左图显示波形蛋白中间丝网络的重组，结果显示， 在用化合物c50处理的u87细胞中，波形蛋白网络从细胞的外围近细胞膜回 缩至中心近细胞核周围，并与囊泡状结构相连；右图显示gfap网络没有变化。 b：波形蛋白丝的可流动性受损；在表达gfp-波形蛋白的u87细胞中，光冲 击后的荧光缺损在dmso处理的细胞中迅速得到修复，但在c50处理的细胞 中长时间得不到修复。c：dmso和c50处理的细胞中荧光回复率的定量分析， 测量了在光冲击之前和之后的每间隔30秒目标区域的荧光强度。统计显著意 义*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。[0025]图2：化合物c52抑制细胞的内吞和内体转运。图示pmax-gfp转染的 细胞的gfp荧光强度。化合物c52处理细胞的时间点为：a，整个转染过程给 予；b，仅在转染前；c，仅在转染后。d为a、b和c三种条件的剂量反应 曲线。化合物c52处理细胞的浓度单位：μm；每个数据点n＝6；数据表示为 平均值±sem。[0026]图3：多种均三嗪衍生物，例如c45，c52，c69a，c69b和c52m，都 能有效抑制肝癌细胞外泌体的释放。huh7-nc12用各种化合物处理48小时后， 细胞用于测定生存率(a)，上清培养液用于测定外泌体的含量(b)。化合 物gw4869，c45，c52，c69a即使在最高浓度(10,000nm)均无明显的细胞 毒性，而化合物c69b和c52m在高浓度(3,160和10,000nm)具有细胞毒 性。所有化合物对肝癌细胞外泌体的释放都有一定程度的抑制。数据表示为平 均值±sd，n＝3。[0027]图4：化合物c52抑制肺癌和胰腺癌外泌体的分泌。(a)用dmso或5 μm c52处理的肺癌a549和胰腺癌panc-1细胞的培养液纯化的外泌体，代 表性透射电子显微图片(红色箭头)。比例尺：100nm。(b)用dmso或1 μm c52处理a549和panc-1细胞，相同数量细胞的细胞培养上清液经连续 超速离心从中分离外泌体，并进行纳米颗粒追踪分析(nta)。(c)三个独 立实验的nta定量。(d)用dmso或0.1μm，1μm和10μm c52处理48 小时的a549细胞的蛋白质印迹分析。对来自细胞(细胞内)和细胞外液(细 胞外)的提取物进行印迹，以检测外泌体标志蛋白cd9，cd63和tsg101。 (e)在三个独立的实验中，对从a549细胞和细胞外液中提取的外泌体标志 蛋白质进行定量。(f)用dmso或0.1μm，1μm和10μm的c52处理48 小时的panc-1细胞的蛋白质印迹分析。对来自细胞和细胞外液的提取物进行 印迹，以检测外泌体标志蛋白cd9，cd63和tsg101。(g)在三个独立的实 验中，对从panc-1细胞和细胞外液中提取的外泌体标志蛋白质进行定量。数 据表示为平均值±sem(n＝3)。*p《0.05，**p《0.01和***p《0.001(两尾 student t检验)。[0028]图5：波形蛋白调节外泌体的形成和释放，而与波形蛋白结合的化合物 c52仅抑制外泌体的释放。(a)来自u87 vim+/+和u87 vim+/-细胞裂解液的 代表性蛋白质印迹分析，显示波形蛋白四聚体和波形蛋白单体。(b)在三个 独立实验中定量来自(a)的波形蛋白的蛋白质水平。(c)用dmso或2μmc52处理72小时后，来自相等数量的u87 vim+/+和u87 vim+/-细胞的细胞裂 解液的代表性蛋白质印迹分析。印迹细胞裂解液(细胞内)中的外泌体标志蛋 白cd9和cd63，以及β-肌动蛋白作为上样对照。(d-e)在三个独立的实验 中对(c)中的外泌体标志蛋白cd9和cd63的蛋白质水平进行定量。(f) 用dmso或2μm的c52处理具有相等数量的u87 vim+/+和u87 vim+/-细胞 72小时后，从培养液中纯化的胞外小囊泡，提取细胞外囊泡裂解物(细胞外)， 并对其外泌体标志蛋白cd9和cd63进行印迹。图示为代表性的蛋白质印迹分 析。(g-h)在三个独立的实验中对(f)中的外泌体标志蛋白cd9和cd63 进行定量。数据表示为平均值±sem(n＝3)。*p《0.05，**p《0.01和***p 《0.001(双尾学生t检验)。[0029]图6：与波形蛋白结合的化合物c52显著抑制癌细胞的迁移和侵袭，并能 在体内减少血液中外泌体的含量。(a，b)伤口愈合试验，显示了在dmso 或不同浓度的c52处理a549细胞48小时(a)或panc-1细胞24小时(b) 之前和之后，a549和panc-1细胞的迁移情况(左)，以及细胞融合程度定 量(右)。比例尺：300μm。(c，d)transwell侵袭性生长能力测定，显示 以dmso或不同浓度c52处理24小时的(c)a549或(d)panc-1细胞的 迁移(左)，并对迁移的细胞进行定量(右)。(e)c52(100mg/kg，n＝3) 或溶媒(n＝3))，灌胃小鼠，每天一次共14天后，测定小鼠血浆中外泌体 含量变化。蔗糖密度梯度离心纯化血浆细胞外囊泡，裂解液蛋白印迹分析外泌 体标志物cd63和tsg101(左)。在三个独立的western印迹中的外泌体蛋 白定量(右)。比例尺：300μm。数据表示为平均值±sem(n＝3)。*p《0.05， **p《0.01(双尾学生t检验)。[0030]图7：化合物c52体外强烈抑制新型冠状病毒肺炎sars-cov2假病毒对 细胞的感染。(a)被新冠假病毒(pseudovirus-2019-ncov)感染细胞的荧光 强度。整个感染过程中都加有化合物c52，nh4cl处理的细胞作为抑制对照。 (b-d)感染新冠假病毒-2019-ncov后48小时终点，细胞终末荧光素酶测定。 图中2e+6,2e+5,2e+4表示实验使用的病毒滴度。图示化合物c52的浓度单位 为μm；每个数据点n＝3；数据表示为平均值±sem。[0031]图8：体内，化合物c52可显著改善患有sars-cov2病毒感染的老年小 鼠的临床症状和肺出血。a：预防性给药，动物体重变化；b：预防性给药， 动物肺出血评分；c：治疗性给药，动物体重变化；d：治疗性给药，动物肺 出血评分。统计显著意义*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001(与感染动物 溶媒组比较)。[0032]图9：化合物c52m的分析鉴定。(a)质谱图；(b)核磁图谱。具体实施方式[0033]应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。[0034]本发明发现，一系列的均三嗪衍生物可以改变波形蛋白丝的空间分布和可 流动性，进而抑制细胞内吞、内体转运和外泌体释放。具体而言，本发明使用 代表性的均三嗪衍生物，展示这类化合物影响波形蛋白的细胞内的空间分布和 物理特性，抑制细胞内吞，干扰内体转运，阻断外泌体分泌通路。使用crispr 基因编辑，我们发现波形蛋白能控制外泌体的生成和释放，本文的均三嗪衍生 物可以通过影响波形蛋白而减少外泌体释放。该类化合物，针对癌症，能有效 抑制多种癌细胞的迁移能力，抑制多种癌细胞外泌体的释放；针对病原体感染， 能有效降低慢病毒(hiv)载体对细胞的感染，强力抑制新型冠状病毒刺突蛋 白和人ace2受体介导的病毒感染，降低血液循环中的外泌体含量，能明显改 善感染sars-cov-2小鼠的症状并减少其肺部损伤。因此，该类均三嗪衍生物 对多种不同的疾病(包括病原体感染和癌症)具有预防和治疗作用。[0035]本发明的均三嗪衍生物优选具有下式a所示的结构式：[0036][0037]式中：[0038]r1为氢、卤素、硝基、氨基、羟基、c1-c12烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷 氨基、二c1-c6烷氨基、羟甲基或胺甲基；[0039]r2为-nr4r5，r4和r5独立地选自氢、c1-c6烷基和c1-c6卤代烷基，或者 r4和r5与它们所连的氮原子一起形成任选含有另外的选自nr6、o和s的杂 原子的4至6元饱和或不饱和杂环，所述杂环可以被羟基、卤素、硝基、氨基 或c1-c6烷基取代，其中r6为氢、羟基、c1-c6烷基或c1-c6卤代烷基；[0040]z为任选被1-3个r3取代的芳基或杂芳基；[0041]r3为氢、卤素、硝基、氨基、羟基、c1-c12烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷 氨基、二c1-c6烷氨基、羟甲基、胺甲基或-cora；[0042]ra为oh或nr7r8，r7和r8独立选自氢、任选被一个或多个选自卤素或nr9r10的取代基取代的c1-c6烷基和被3-(c2-c6炔基)-3h-双吖丙啶基取代 的c1-c6烷基，或者r7和r8与它们所连的氮原子一起形成任选含有另外的选 自n、o和s的杂原子的任选被c1-c6烷基取代的4至6元杂环；[0043]r9和r10独立选自氢和c1-c6烷基，或者r9和r10与它们所连的氮原子一 起形成任选含有另外的选自n、o、s的杂原子的4至6元杂环；和[0044]x为nh或o，与苯基的间位或对位连接。[0045]优选地，式a的z中，芳基为6-14元芳基，如苯基或萘基；杂芳基为5-10 元杂芳基，优选为含氮杂芳基，包括但不限于咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶 基、吡嗪基、哒嗪基、吡咯基、三唑基和四唑基。优选的z为任选被1或2个 r3取代的苯基或吡啶基。[0046]本发明的均三嗪衍生物优选为us 16/300,162所述的均三嗪衍生物，本文 将其全部内容以引用的方式纳入本文。更具体而言，本发明的均三嗪衍生物为 2,4,6-三取代均三嗪化合物，具有下式i所示的结构：[0047][0048]式中：[0049]r1为氢、卤素、硝基、氨基、羟基、c1-c12烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷 氨基、二c1-c6烷氨基、羟甲基或胺甲基；[0050]r2为-nr4r5，r4和r5独立地选自氢、c1-c6烷基和c1-c6卤代烷基，或者 r4和r5与它们所连的氮原子一起形成任选含有另外的选自nr6、o和s的杂 原子的4至6元饱和或不饱和杂环，所述杂环可以被羟基、卤素、硝基、氨基 或c1-c6烷基取代，其中r6为氢、羟基、c1-c6烷基或c1-c6卤代烷基；[0051]r3为氢、卤素、硝基、氨基、羟基、c1-c12烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷 氨基、二c1-c6烷氨基、羟甲基、胺甲基或-cora；[0052]ra为oh或nr7r8，r7和r8独立选自氢、任选被一个或多个选自卤素或 nr9r10的取代基取代的c1-c6烷基和被3-(c2-c6炔基)-3h-双吖丙啶基取代 的c1-c6烷基，或者r7和r8与它们所连的氮原子一起形成任选含有另外的选 自n、o和s的杂原子的任选被c1-c6烷基取代的4至6元杂环；[0053]r9和r10独立选自氢和c1-c6烷基，或者r9和r10与它们所连的氮原子一 起形成任选含有另外的选自n、o、s的杂原子的4至6元杂环；和[0054]x为nh或o，与苯基的间位或对位连接。[0055]本发明所用的均三嗪衍生物也包括式a和i所示化合物的药学上可接受的 盐、前药、对映异构体、非对映异构体、互变异构体或溶剂化物。[0056]式a和式i中，优选地，r1为氢、卤素或硝基，更优选为h、f、cl或硝 基。[0057]式a和式i中，优选地，r2为-nr4r5，r4和r5独立地选自氢、c1-c6烷 基和c1-c6卤代烷基，或者r4和r5与它们所连的氮原子一起形成任选含有另 外的选自nr6、o和s的杂原子的4-6元饱和或不饱和杂环，所述杂环可以被 羟基、卤素、硝基、氨基或c1-c6烷基取代，其中r6为氢、羟基或c1-c6烷基。 优选地，r4和r5独立地选自氢和c1-c6烷基，或者r4和r5与它们所连的氮原 子一起形成任选含有另外的选自nr6、o和s的杂原子的4-6元饱和杂环，所 述杂环可以被羟基、卤素、硝基、氨基或c1-c6烷基取代，其中，r6为氢或 c1-c6烷基。优选地，r4和r5与它们所连的氮原子一起形成任选含有另外的选 自nr6和o的杂原子的4-6元饱和杂环，所述杂环任选被选自羟基和c1-c6烷 基的取代基取代，其中，r6为氢或c1-c6烷基。杂环上取代基的数量通常为1、 2或3个。优选地，所述4-6元饱和杂环包括但不限于吗啉基、吡咯烷基、哌 嗪基、哌啶基和氮杂环丁烷基。[0058]式a和式i中，优选地，r3为氢、卤素、硝基、氨基、羟基、c1-c6烷基、 羟甲基、胺甲基或-cora，其中，ra为oh或nr7r8，r7和r8独立选自氢、任 选被一个或多个选自卤素或nr9r10的取代基取代的c1-c6烷基和被3-(c2-c6炔基)-3h-双吖丙啶基取代的c1-c6烷基，或者r7和r8与它们所连的氮原子 一起形成任选含有另外的选自n、o和s的杂原子的任选被c1-c6烷基取代的 4至6元杂环；r9和r10独立选自氢和c1-c6烷基，或者r9和r10与它们所连 的氮原子一起形成任选含有另外的选自n、o、s的杂原子的4至6元杂环。 优选地，r3为卤素、c1-c6烷氧基或-cora，ra为oh或nr7r8，r7和r8独立 选自任选被nr9r10取代的c1-c6烷基和被3-(c2-c6炔基)-3h-双吖丙啶基取 代的c1-c6烷基，或者r7和r8与它们所连的氮原子一起形成任选含有另外的 选自n或o的杂原子的任选被c1-c6烷基取代的4至6元饱和杂环；r9和r10独立选自氢和c1-c6烷基，或者r9和r10与它们所连的氮原子一起形成任选含 有另外的选自n或o的杂原子的4至6元饱和杂环。优选地，r7和r8与它们 所连的氮原子一起形成的杂环以及r9和r10与它们所连的氮原子一起形成的杂 环包括但不限于哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基和吗啉基。优选地，当r3为非h 取代基时，其通常位于苯基的间位或对位上。[0059]式a和式i中，优选地，x为nh，与苯基的对位或间位连接；或者x为 o，与苯基的对位连接。[0060]在优选的实施方案中，所示式a和式i中：[0061]r1为氢、卤素或硝基；[0062]r2为-nr4r5，r4和r5独立地选自氢、c1-c6烷基和c1-c6卤代烷基，或者 r4和r5与它们所连的氮原子一起形成任选含有另外的选自nr6、o和s的杂 原子的4至6元饱和或不饱和杂环，所述杂环可以被羟基、卤素、硝基、氨基 或c1-c6烷基取代，其中r6为氢、羟基或c1-c6烷基；和[0063]r3为氢、卤素、硝基、氨基、羟基、c1-c6烷基、羟甲基、胺甲基或-cora， 其中，ra为oh或nr7r8，r7和r8独立选自氢、任选被一个或多个选自卤素 或nr9r10的取代基取代的c1-c6烷基和被3-(c2-c6炔基)-3h-双吖丙啶基取 代的c1-c6烷基，或者r7和r8与它们所连的氮原子一起形成任选含有另外的 选自n、o和s的杂原子的任选被c1-c6烷基取代的4至6元杂环；r9和r10独立选自氢和c1-c6烷基，或者r9和r10与它们所连的氮原子一起形成任选含 有另外的选自n、o、s的杂原子的4至6元杂环。[0064]在优选的实施方案中，所示式a和式i中：[0065]r1为氢、卤素或硝基；[0066]r2为-nr4r5，r4和r5与它们所连的氮原子一起形成任选含有另外的选自 nr6和o的杂原子的4至6元饱和杂环，所述杂环任选被选自羟基和c1-c6烷 基的取代基取代，其中，r6为氢或c1-c6烷基；[0067]r3为卤素或-cora，ra为oh或nr7r8，r7和r8独立选自任选被nr9r10取代的c1-c6烷基和被3-(c2-c6炔基)-3h-双吖丙啶基取代的c1-c6烷基，或 者r7和r8与它们所连的氮原子一起形成任选含有另外的选自n或o的杂原子 的任选被c1-c6烷基取代的4至6元饱和杂环；r9和r10独立选自氢和c1-c6烷基，或者r9和r10与它们所连的氮原子一起形成任选含有另外的选自n或o 的杂原子的4至6元饱和杂环；和[0068]x为nh，与苯基的对位或间位连接。[0069]在某些实施方案中，优选地，式a和式i中：[0070]r1为氢、卤素或硝基；[0071]r2为-nr4r5，r4、r5独立地选自氢、c1-c6烷基、c1-c6卤代烷基、或者 r4和r5与它们所连的氮原子一起形成任选含有另外的选自nr6、o、s的杂原 子的4至6元饱和或不饱和杂环，所述杂环可以被羟基、卤素、硝基、氨基或 c1-c6烷基取代，其中r6为氢、羟基、c1-c6烷基；[0072]r3为氢、卤素、硝基、氨基、羟基、c1-c6烷基、羟甲基、胺甲基、-conr7r8， 其中r7、r8独立选自氢、c1-c6任选取代烷基，或者r7和r8与它们所连的氮 原子一起形成任选含有另外的选自n、o、s的杂原子的4至6元杂环；其中 c1-c6烷基可被任选一个或多个卤素、c1-c6烷基氨基、二c1-c6烷基氨基取代；[0073]x基团为间位和对位nh或o。[0074]在某些实施方案中，更优选地，式a和式i中：[0075]r1为氢、卤素或硝基；[0076]r2为-nr4r5，r4、r5独立地选自氢、c1-c6烷基、或者r4和r5与它们所 连的氮原子一起形成任选含有另外的选自nr6、o、s的杂原子的4至6元饱 和杂环，所述杂环可以被羟基、卤素、硝基、氨基或c1-c6烷基取代，r6为氢、 c1-c6烷基；[0077]r3为氢、卤素或-conr7r8，其中r7、r8独立选自氢、任选c1-c6取代烷 基，或者r7和r8与它们所连的氮原子一起形成任选含有另外的选自n、o、s 的杂原子的4至6元饱和杂环；其中c1-c6烷基可被任选一个或多个c1-c6烷 基氨基、二c1-c6烷基氨基取代；[0078]x基团为间位和对位nh或o。[0079]在优选的实施方案中，本文式i化合物具有下式i-1或下式i-2所示的结构：[0080][0081]式中，[0082]r1选自h、卤素和硝基；[0083]r2选自任选被羟基或c1-c6烷基取代的吗啉基、吡咯烷基、哌嗪基和氮杂 环丁烷基；和[0084]r3为卤素或cora；其中，ra为oh或nr7r8，r7和r8独立选自任选被 nr9r10取代的c1-c6烷基和被3-(c2-c6炔基)-3h-双吖丙啶基取代的c1-c6烷基，或者r7和r8与它们所连的氮原子一起形成任选含有另外的选自n或o 的杂原子的任选被c1-c6烷基取代的4至6元饱和杂环；r9和r10独立选自氢 和c1-c6烷基，或者r9和r10与它们所连的氮原子一起形成任选含有另外的选 自n或o的杂原子的4至6元饱和杂环。[0085]优选地，上述式i-2中，r3为卤素。[0086]优选地，上述式i-1中，r1选自h和卤素(优选cl)；r2选自吗啉基(优 选吗啉代)；r3为卤素或cora，其中，ra为oh或nr7r8，r7和r8与它们 所连的氮原子一起形成任选含有另外的选自n或o的杂原子的任选被c1-c6烷基取代的4至6元饱和杂环，优选哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基或氮杂环丁烷 基，更优选形成被c1-c4烷基取代的哌啶基或哌嗪基。[0087]在优选的实施方案中，本文式i化合物具有下式i-3所示的结构：[0088][0089]式中，[0090]r1为h；[0091]r2为吗啉基；[0092]ra为oh或nr7r8，r7和r8独立选自任选被nr9r10取代的c1-c6烷基和 被3-(c2-c6炔基)-3h-双吖丙啶基取代的c1-c6烷基，或者r7和r8与它们所 连的氮原子一起形成任选含有另外的选自n或o的杂原子的任选被c1-c6烷基 取代的4至6元饱和杂环；r9和r10独立选自氢和c1-c6烷基，或者r9和r10与它们所连的氮原子一起形成任选含有另外的选自n或o的杂原子的4至6 元饱和杂环。[0093]在某些式i-1的实施方案中，r1选自h、卤素和硝基；r2为吗啉基；r3为卤素或cora；其中，ra为oh或nr7r8，r7和r8独立选自任选被nr9r10取代的c1-c6烷基和被3-(c2-c6炔基)-3h-双吖丙啶基取代的c1-c6烷基，或 者r7和r8与它们所连的氮原子一起形成任选含有另外的选自n或o的杂原子 的任选被c1-c6烷基取代的4至6元饱和杂环；r9和r10独立选自氢和c1-c6烷基，或者r9和r10与它们所连的氮原子一起形成任选含有另外的选自n或o 的杂原子的4至6元饱和杂环。在某些实施方案中，这些化合物中，r1(为非 氢取代基时)和r3各自独立位于苯基的间位或对位。在某些实施方案中，这 些化合物中，r1为非氢取代基时，位于苯基的间位，r3位于苯基的对位。在 某些实施方案中，这些化合物中，所述饱和杂环包括但不限于哌嗪基、哌啶基、 吡咯烷基和吗啉基。[0094]优选地，式a化合物具有下式a-1所示的结构：[0095][0096]式中：[0097]r3为氢、卤素、硝基、氨基、羟基、c1-c6烷基、羟甲基、胺甲基或-conr7r8， 其中r7、r8独立选自氢、c1-c6任选取代烷基，或者r7和r8与它们所连的氮 原子一起形成任选含有另外的选自n、o、s的杂原子的4至6元杂环；其中 c1-c6烷基可被任选一个或多个卤素、c1-c6烷基氨基、二c1-c6烷基氨基取代。[0098]优选地，式a-1中，r3为h或卤素。[0099]优选地，本发明的式a化合物选自以下化合物l1-l42以及药学上可接受 的盐、前药、对映异构体、非对映异构体、互变异构体和溶剂化物：[0100][0101][0102][0103][0104][0105][0106][0107][0108][0109]以及化合物l42(c52m)：[0110][0111]本文所述的式a化合物可参照us 16/300,162中披露的方法制备。[0112]本文中，“烷基”指c1-c12烷基，如c1-c6烷基，如甲基、乙基、正丙基、 异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基等。[0113]“杂环”指任选含有选自n、o和s的杂原子的4至6元杂环。杂环可以是 饱和杂环或不饱和杂环。示例性的杂环包括但不限于如吗啉基、吡咯烷基、哌 嗪基、哌啶基、氮杂环丁烷基、吡唑基等。[0114]“卤素”包括f、cl、br和i。[0115]“羧基”指-cooh。[0116]“3-(c2-c6炔基)-3h-双吖丙啶基”中，c2-c6炔基的炔基位置通常位于1 位。在某些实施方案中，所述“3-(c2-c6炔基)-3h-双吖丙啶基”为“3-(1-丁炔??4-基)-3h-双吖丙啶-3-基”。[0117]本文中，nr7r8和nr9r10可以是单c1-c6烷基氨基或二c1-c6烷基氨基， 所述c1-c6烷基可任选地被取代，例如被一个或多个卤素、单c1-c6烷基氨基 或二c1-c6烷基氨基取代，或被含n和任选的额外的n或o的4到6元饱和 杂环取代。这些杂环包括但不限于哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基、吗啉基等。所 述杂环也可被任选地取代，例如被c1-c6烷基取代。[0118]本文中，“芳基”指具有6至18个碳原子(优选具有6至14个碳原子、 更优选具有6至10个碳原子，例如6、7、8、9或10个碳原子)的共轭烃环 体系基团。芳基可以为单环、双环、三环或更多环的环体系，还可以与上文所 定义的环烷基或杂环基稠合，条件是芳基经由芳香环上的原子通过单键与分子 的其余部分连接。本文各实施方案所述的芳基的实例包括但不限于苯基、萘基、 蒽基、菲基、芴基、2,3-二氢-1h-异吲哚基、2-苯并噁唑啉酮、2h-1,4-苯并噁 嗪-3(4h)-酮-7-基等。[0119]在本技术中，作为基团或是其它基团的一部分，术语“杂芳基”意指环内 具有1至15个碳原子(优选具有1至10个碳原子，例如1、2、3、4、5、6、7、 8、9或10个碳原子)和1至6个选自氮、氧和硫的杂原子的5元至16元共轭 环系基团。除非本说明书中另外特别指明，否则杂芳基可为单环、双环、三环 或更多环的环体系，还可以与上文所定义的环烷基或杂环基稠合，条件是杂芳 基经由芳香环上的原子通过单键与分子的其余部分连接。杂芳基中的氮、碳或 硫原子可任选地被氧化；氮原子可任选地被季铵化。就本发明的目的而言，杂 芳基优选为包含1至5个选自氮、氧和硫的杂原子的稳定的5元至12元芳香 性基团，更优选为包含1至4个选自氮、氧和硫的杂原子的稳定的5元至10 元芳香性基团或者包含1至3个选自氮、氧和硫的杂原子的5元至6元芳香性 基团。本文各实施方案所述的杂芳基的实例包括但不限于噻吩基、咪唑基、吡 唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、噁二唑基、异噁唑基、吡啶基、嘧啶基、 吡嗪基、哒嗪基、苯并咪唑基、苯并吡唑基、苯并吲哚基、苯并吗啉基、苯并 异二唑基、吲哚基、呋喃基、吡咯基、三唑基、四唑基、三嗪基、吲嗪基、异 吲哚基、吲唑基、异吲唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、二氮萘基、萘啶基、 喹噁啉基、蝶啶基、咔唑基、咔啉基、菲啶基、菲咯啉基、吖啶基、吩嗪基、 异噻唑基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、噁三唑基、噌啉基、喹唑啉基、苯硫基、 中氮茚基、邻二氮杂菲基、异噁唑基、吩噁嗪基、吩噻嗪基、4,5,6,7-四氢苯并 [b]噻吩基、萘并吡啶基、[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪、[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪、 [1,2,4]三唑并[4,3-c]嘧啶、[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶、咪唑并[1,2-a]吡啶、咪唑 并[1,2-b]哒嗪、咪唑并[1,2-a]吡嗪等。[0120]本文中，当基团被取代时，取代基的数量可以是例如1、2、3或4个不等。 通常，除非另有说明，取代基可选自卤素、c1-c6烷基、羟基、羧基、氨基、 单c1-c6烷基氨基、二c1-c6烷基氨基、硝基、3-(c2-c6炔基)-3h-双吖丙啶 基、杂环基(如吗啉基、吡咯烷基、哌嗪基、哌啶基、氮杂环丁烷基、吡唑基 等)和c6-c14芳基(如苯基)等。[0121]本文所用的相关术语诸如“异构体”，“外消旋体”，“前体药物”，“溶剂化物”?与所属领域中所述术语的一般含义并无明显不同。本领域的普通技术人员应该 知道这些术语的含义。例如，术语“异构体”是指分子组成相同、但结构和性 质不同的两种或多种化合物之一。术语“外消旋体”是指一种具有旋光性的手性 分子与其对映体的等摩尔混合物。术语“前药”也称前体药物、药物前体、前驱 药物等，是指经过生物体内转化后才具有药理作用的化合物。术语“溶剂化物”?是指溶剂和化合物组成的混合物。[0122]本文中，术语“药学上可接受的盐”包括药学上可接受的酸加成盐和药学 上可接受的碱加成盐。[0123]本文中，“药学上可接受的酸加成盐”是指能够保留游离碱的生物有效性 而无其它副作用的，与无机酸或有机酸所形成的盐。无机酸盐包括但不限于盐 酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等；有机酸盐包括但不限于甲酸盐、 乙酸盐、2,2-二氯乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、己酸盐、辛酸盐、癸酸盐、 十一碳烯酸盐、乙醇酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐、癸二酸盐、己二酸盐、戊二酸 盐、丙二酸盐、草酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸 盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、油酸盐、肉桂酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、谷氨酸 盐、焦谷氨酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸 盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐、4-氨基水杨酸盐、萘二磺酸盐等。这 些盐可通过本专业已知的方法制备。[0124]本文中，“药学上可接受的碱加成盐”是指能够保持游离酸的生物有效性 而无其它副作用的、与无机碱或有机碱所形成的盐。衍生自无机碱的盐包括但 不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝 盐等。优选的无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐及镁盐。衍生自有机碱的盐包 括但不限于以下的盐：伯胺类、仲胺类及叔胺类，被取代的胺类，包括天然的 被取代胺类、环状胺类及碱性离子交换树脂，例如氨、异丙胺、三甲胺、二乙 胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲 氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、 普鲁卡因、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可碱、嘌呤、 哌嗪、哌啶、n-乙基哌啶、聚胺树脂等。优选的有机碱包括异丙胺、二乙胺、 乙醇胺、三甲胺、二环己基胺、胆碱及咖啡因。这些盐可通过本专业已知的方 法制备。[0125]本发明化合物的前药的实施例可包括含有羧酸的化合物的简单酯(例如依 据本领域已知方法通过与c1-4醇缩合而获得的酯)；含有羟基的化合物的酯 (例如依据本领域已知方法通过与c1-4羧酸、c3-6二酸或其酸酐例如琥珀酸 酐和富马酸酐缩合而获得的酯)；含有氨基的化合物的亚胺(例如依据本领域 已知方法通过与c1-4醛或酮缩合而获得的亚胺)；含有氨基的化合物的氨基 甲酸酯，例如leu等人(j.med.chem.，42:3623-3628(1999))和greenwald等 人(j.med.chem.，42:3657-3667(1999))描述的那些酯；含有醇的化合物的醛 缩醇或酮缩醇(例如依据本领域已知方法通过与氯甲基甲基醚或氯甲基乙基醚 缩合而获得的那些缩醇)。[0126]本发明涉及本文所述的式a化合物(包括所述式i化合物、式i-1化合物、 式i-2化合物、式i-3化合物以及式a-1化合物)或其药学上可接受的盐、前 药、对映异构体、非对映异构体、互变异构体或溶剂化物在制备治疗或预防与 细胞内吞、外吐和内体转运相关的疾病的药物中的用途。本发明还涉及用于治 疗或预防与细胞内吞、外吐和内体转运相关的疾病的本发明所述的本文所述的 式a化合物(包括所述式i化合物、式i-1化合物、式i-2化合物、式i-3化合 物以及式a-1化合物)或其药学上可接受的盐、前药、对映异构体、非对映异 构体、互变异构体或溶剂化物，及其药物组合物。本文还包括治疗或预防与细 胞内吞、外吐和内体转运相关的疾病的方法，所述方法包括给予需要的对象治 疗或预防有效量的本文所述的式a化合物(包括所述式i化合物、式i-1化合 物、式i-2化合物、式i-3化合物以及式a-1化合物)或其药学上可接受的盐、 前药、对映异构体、非对映异构体、互变异构体或溶剂化物，或给予治疗或预 防有效量的本文所述的药物组合物。[0127]本文中，“药物组合物”指本发明化合物和所属领域中公认用于递送生物 活性化合物至哺乳动物(例如，人)的介质的制剂。这种介质包括其所有药学 上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。[0128]本文中，“治疗有效量”是指在必需剂量下和持续必需时间段，有效实现 所需治疗结果(如降低的肿瘤大小、增加的寿命或增加的预期寿命)的量。化 合物的治疗有效量可根据如下因素改变，如受试者的疾病状态、年龄、性别和 重量，和所述化合物在所述受试者中引起所需反应的能力。给药方案可经过调 节以提供最佳治疗反应。治疗有效量也为其中所述化合物的任何毒性或有害效 应均由治疗有益效应超过的量。“预防有效量”是指在必需剂量下和持续必需 时间段，有效实现所需预防结果(如较小肿瘤、增加的寿命、增加的预期寿命) 的量。通常，预防剂量在疾病的早期阶段之前或在疾病的早期阶段用于受试者 中，使得预防有效量可以小于治疗有效量。在优选的实施方案中，所施用的本 文所述的化合物的量足以干扰癌细胞生长和扩散或破坏引起病原体感染所需 的一个或多个细胞过程。[0129]如本文所用，“治疗”涵盖患有所关注的疾病或病状的哺乳动物(优选为 人)中的所关注的疾病或病状的治疗，并且包括：[0130](i)预防所述疾病或病状在哺乳动物中发生，特别是当所述哺乳动物易患 所述病状但尚未经诊断患有所述病状时；[0131](ii)抑制所述疾病或病状，即，遏制其发展；[0132](iii)减轻所述疾病或病状，即，使所述疾病或病状消退；或[0133](iv)减轻由所述疾病或病状引起的症状，即，减轻疼痛而未解决潜在疾 病或病状。[0134]本文所用术语“服用”、“施用”、“给药”等是指能够将化合物或组合 物递送到进行生物作用的所需位点的方法。本领域周知的给药方法均可用于本 发明。这些方法包括但不限于口服途径、经十二指肠途径、胃肠外注射(包括 肺内、鼻内、鞘内、静脉内、皮下、腹膜内、肌内、动脉内注射或输注)、局 部给药和经直肠给药。本领域技术人员熟知可用于本文所述化合物和方法的施 用技术，例如在goodman and gilman,the pharmacological basis of therapeutics, current ed.；pergamon；and remington’s,pharmaceutical sciences(current edition), mack publishing co.,easton,pa中讨论的那些。[0135]本文中，优选地，所述与细胞内吞、外吐和内体转运相关的疾病为波形蛋 白介导的疾病。具体而言，本发明化合物通过抑制波形蛋白，可抑制细胞的內 吞、抑制细胞的内体转运和/或抑制癌细胞释放外泌体，从而达到治疗或预防所 述与细胞内吞、外吐和内体转运相关的疾病的效果。[0136]本文中，优选地，所述与细胞内吞、外吐和内体转运相关的疾病包括癌症 和病原体感染，以及一个或多个细胞过程异常导致发病的其它疾病。优选地， 所述癌症具有以下特征：其癌症细胞利用波形蛋白实现侵袭性生长，利用内吞 摄取营养，利用外吐释放外泌体作为媒介与其它细胞通讯，营造适合癌细胞生 长和转移所需的微环境。在一些实施方案中，所述癌症包括：结肠癌、胰腺癌、 卵巢癌、胃癌、乳腺癌、甲状腺癌、肝癌、肾癌、肺癌(如非小细胞肺癌)、 前列腺癌、肉瘤、胶质瘤、血病和多发性骨髓癌。优选地，所述癌症是波形蛋 白介导的癌症。在一些实施方案中，所述癌症为肝癌、肺癌、胶质瘤和胰腺癌。[0137]本文中，所述病原体可以是细菌和/或病毒。通常，所述病原体通过内吞作 用进入细胞，通过内体途径在细胞内运输和/或通过外泌体途径从细胞中释出子 代。优选地，所述病原体可选自：冠状病毒(包括sars-cov-2)，艾滋病毒， 流感病毒，乙肝病毒，丙肝病毒，人乳头瘤病毒，埃博拉病毒，登革热病毒， 大肠杆菌，肠炎沙门氏菌，嗜吞噬细胞无形体，沙眼衣原体，化脓性链球菌， 结核分枝杆菌，鸟型分枝杆菌和痤疮丙酸杆菌中的一种或多种。优选地，所述 病原体感染为这些病原体中的一种或多种病原体引起的感染。优选地，所述病 原体感染引起的疾病为传染性疾病或感染性疾病，包括但不限于新型冠状病毒 肺炎，艾滋病，乙型肝炎，流行性感冒，黏附侵入性大肠杆菌(aiec)感染。 在一些实施方案中，所述与细胞内吞、外吐和内体转运相关的疾病包括病原体 感染引起的各种症状和/或组织损伤，如冠状病毒尤其是新型冠状病毒 sars-cov-2引起的临床症状和肺部损伤。[0138]因此，本文中，所述“细胞”可以是正常组织的细胞，也可以是患病组织 的细胞。本文所述的化合物可通过抑制正常组织的细胞的內吞和内体转移来阻 止来自患病组织细胞的外泌体进入该正常组织的细胞内并在正常组织的细胞 之间进行传播，从而预防、阻止或减缓疾病的进展，也可以抑制患病组织细胞 的內吞和内体转移，从而阻止或延缓该患病组织细胞健康程度的进一步恶化。 另一方面，本文所述的化合物可通过抑制患病或感染细胞中的外泌体的排出， 从而预防、阻止或减缓正常组织的细胞被感染或被同质化，阻止或延缓疾病的 进展。[0139]在优选的实施方案中，本文涉及本文所述的式a化合物(包括所述式i化 合物、式i-1化合物、式i-2化合物、式i-3化合物以及式a-1化合物)或其药 学上可接受的盐、前药、对映异构体、非对映异构体、互变异构体或溶剂化物 在制备治疗或预防癌症的药物中的用途，以及在制备治疗或预防病原体感染或 病原体感染引起的疾病的药物中的用途。本文也涉及用于治疗或预防癌症或病 原体感染或病原体感染引起的疾病的本发明所述的本文所述的式a化合物(包 括所述式i化合物、式i-1化合物、式i-2化合物、式i-3化合物以及式a-1化 合物)或其药学上可接受的盐、前药、对映异构体、非对映异构体、互变异构 体或溶剂化物，及其药物组合物。本文还包括治疗或预防癌症或病原体感染或 病原体感染引起的疾病的方法，所述方法包括给予需要的对象治疗或预防有效 量的本文所述的式a化合物(包括所述式i化合物、式i-1化合物、式i-2化 合物、式i-3化合物以及式a-1化合物)或其药学上可接受的盐、前药、对映 异构体、非对映异构体、互变异构体或溶剂化物，或给予治疗或预防有效量的 本文所述的药物组合物。[0140]本文中，所述个体或对象优选是哺乳动物，更优选是人。[0141]本文中，可通过同时或顺序施用至少1、2、3或更多种本文所述的化合物 来实现治疗益处。本文所述的化合物或药物组合物也可与其它疗法组合以提供 组合的治疗有效剂量。例如，本文所述的化合物或药物组合物可以与其它药物， 优选抗细菌或病毒药联合给药。[0142]本文提供的药物组合物可含有本文任一实施方案所述的式a化合物(包括 所述式i化合物、式i-1化合物、式i-2化合物、式i-3化合物以及式a-1化合 物)或其药学上可接受的盐、前药、对映异构体、非对映异构体、互变异构体 或溶剂化物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。[0143]本文中，“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括但不限于已经由 例如美国食品和药物管理局(fda)批准可接受用于人类或饲养动物的任何佐 剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、风味增 强剂、表面活性剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等张剂、溶剂或乳化 剂。通常，药学上可接受的载体是惰性稀释剂。[0144]在优选的实施方案中，本文的药物组合物包含化合物c45、c50、c52、 c52m、c69a和/或化合物c69b。在一些优选的实施方案中，本发明的药物组 合物含有式i-1所示的化合物、其药学上可接受的盐、前药、对映异构体、非 对映异构体、互变异构体或溶剂化物，其中，r1选自h和卤素(优选cl)， 更优选为h；r2选自吗啉基(优选吗啉代)；r3为卤素或cora，更优选为卤 素；ra为oh或nr7r8，r7和r8与它们所连的氮原子一起形成任选含有另外 的选自n或o的杂原子的任选被c1-c6烷基取代的4至6元饱和杂环，优选哌 啶基、哌嗪基、吡咯烷基或氮杂环丁烷基，更优选形成被c1-c4烷基取代的哌 啶基或哌嗪基。更优选地，本发明的药物组合物含有化合物c50和/或c52。[0145]本文的药物组合物可以采取多种形式以适应所选择的给药途径。本领域技 术人员将认识到可以用于制备本文所述化合物的无毒的药学上可接受的组合 物的各种合成方法。本领域技术人员将认识到可以采用多种无毒的药学上可接 受的溶剂来制备本发明化合物的溶剂化物。[0146]本发明的药物组合物可可以是各种合适的剂型，包括丸剂，胶囊剂，酏剂， 糖浆剂，锭剂，锭剂等形式。本发明的药物组合物可通过各种合适的途径给药， 包括口服，局部，肠胃外，吸入或喷雾或直肠给药等。本文使用的术语“肠胃 外”包括皮下注射，皮内，血管内(例如静脉内)，肌内，脊柱，鞘内注射或 类似的注射或输注技术。[0147]含有本发明化合物的药物组合物优选为适合口服使用的形式，例如片剂， 锭剂，锭剂，水性或油性悬浮液，可分散的粉剂或颗粒剂，乳剂，硬或软胶囊 剂或糖浆剂或酏剂。[0148]用于口服的组合物可以根据本领域已知的用于制备药物组合物的任何方 法来制备，并且这种组合物可以包含一种或多种选自以下的试剂：甜味剂，调 味剂，着色剂和防腐剂。为了提供药学上雅致和可口的制剂。片剂可包含与适 合于制造片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可 以是例如惰性稀释剂，包括碳酸钙，碳酸钠，乳糖，磷酸钙或磷酸钠；制粒 和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉，明胶或阿拉伯胶；润 滑剂，例如硬脂酸镁，硬脂酸或滑石粉。片剂可以是未包衣的，也可以通过已 知技术进行包衣，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而在更长的时间内提供 持续的作用。例如，可以使用延时材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油 酯。[0149]口服制剂还可以以硬明胶胶囊剂的形式存在，其中活性成分与惰性固体稀 释剂(例如碳酸钙，磷酸钙或高岭土)混合，或者以软明胶胶囊剂的形式存在， 其中活性成分与水或油介质，例如花生油，液体石蜡或橄榄油。[0150]水性悬浮液含有与适于制备水性悬浮液的赋形剂混合的活性物质。这样的 赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，藻 酸钠，聚乙烯吡咯烷酮，黄芪胶和阿拉伯胶。分散剂或润湿剂，其可以是天然 存在的磷脂，例如卵磷脂，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂 酸酯，或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物，例如七十八碳乙烯氧基鲸蜡醇， 或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的部分酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨 醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的缩合产物，例 如聚乙烯山梨糖醇单油酸酯。水性悬浮液还可包含一种或多种防腐剂，例如对 羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味 剂以及一种或多种甜味剂，例如蔗糖或糖精。[0151]油性悬浮液可通过将活性成分悬浮在植物油(例如花生油，橄榄油，芝麻 油或椰子油)或矿物油(例如液体石蜡)中来配制。油性悬浮液可包含增稠剂， 例如蜂蜡，硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加诸如上述的甜味剂和调味剂以提供可口 的口服制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂例如抗坏血酸来保存。[0152]适用于通过加水制备水性悬浮液的可分散粉末和颗粒，可提供与分散剂或 湿润剂，助悬剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。合适的分散剂或湿润剂 和助悬剂由上面已经提到的那些举例说明。也可以存在其它赋形剂，例如甜味 剂，调味剂和着色剂。[0153]本发明的药物组合物也可以是水包油乳剂的形式。油相可以是植物油，例 如橄榄油或花生油，或矿物油，例如液体石蜡或这些的混合物。合适的乳化剂 可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄芪胶；天然存在的磷脂，例如大 豆，卵磷脂以及衍生自脂肪酸和己糖醇的酯或偏酯；酸酐，例如脱水山梨糖醇 单油酸酯；所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸 酯。乳液还可以包含甜味剂和调味剂。[0154]糖浆剂和酏剂可以与甜味剂例如甘油，丙二醇，山梨糖醇或蔗糖一起配制。 这样的制剂还可以包含缓和剂，防腐剂以及调味剂和着色剂。药物组合物可以 是无菌可注射的水性或油性悬浮液的形式。该悬浮液可以根据已知技术使用上 面已经提及的那些合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制。无菌注射制剂也可 以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如 在1，3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的溶媒和溶剂是水，林格氏溶液 和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为此， 可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂 肪酸如油酸也可用于注射剂的制备中。[0155]本发明的药物组合物也可以栓剂的形式给药，例如用于直肠给药。这些组 合物可以通过将药物与合适的无刺激性的赋形剂混合来制备，该赋形剂在常温 下为固体，但在直肠温度下为液体，因此将在直肠中融化以释放出药物。这样 的材料是可可脂和聚乙二醇。[0156]或者，可以在无菌介质中肠胃外施用组合物。取决于所用的溶媒和浓度， 药物可以悬浮或溶解在溶媒中。有利地，佐剂例如局部麻醉剂，防腐剂和缓冲 剂可以溶解在溶媒中。[0157]为了施用于非人类动物，可以将含有治疗化合物的组合物添加到动物的饲 料或饮用水中。而且，配制动物饲料和饮用水产品将是方便的，这样动物可以 在其饮食中摄取适当量的化合物。为了进一步方便施用，可将化合物以预混合 物形式存在于组合物中以添加到饲料或饮用水中。该组合物也可以作为人类的 食品或饮料补充剂添加。[0158]在上述状况的治疗中有用的剂量水平包括每天约1mg至约500mg，每天 约5mg至约150mg，更优选每天约5mg至约100mg。可与载体材料组合以产 生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的病症和特定的给药方式而变化。[0159]给药频率也可以根据所用化合物和所治疗的特定疾病而变化。然而，对于 大多数疾病的治疗，优选每天3次或更少的剂量方案。然而，应理解，任何特 定患者的具体剂量水平将取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性，年龄， 体重，总体健康，性别，饮食，给药时间，给药途径和排泄率，药物组合以及 接受治疗的特定疾病的严重程度。[0160]本发明的优选化合物将具有所需的药理学性质，包括但不限于口服生物利 用度，低毒性，低血清蛋白结合性和所需的体外和体内半衰期。对于用于治疗 中枢神经系统疾病的化合物，必须穿透血脑屏障，而用于治疗外周疾病通常优 选在脑组织中暴露水平低的化合物。为了治疗器官特异性疾病，优选在器官中 的富集暴露的化合物和在其它器官或全身暴露最小的化合物。[0161]用于治疗所需的组合物的量不仅会因所选的特定化合物而异，而且还会随 给药途径，所治疗疾病的性质以及患者的年龄和状况的不同而变化，最终将取 决于主治医师或临床医生。[0162]下文将以具体实施方案的形式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐 述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用的方法和材料，除非另有 说明，否则均为本领域常规的方法和可从市售途径获得的材料。[0163]制备例[0164]式a的化合物可参照us 16/300,162中披露的方法制备。[0165]下文示例性地给出化合物l42(c52m)的制备方法。[0166]步骤1[0167][0168]将1(3.0g，23.3mmol)的二恶烷(50ml)溶液冷却至10℃，然后在氮 气下依次滴加正。数据采集后，通过imagej软件提取roi的荧光强度。[0180]结果和结论[0181]为了检测细胞经化合物c50体外处理后，细胞内波形蛋白中间丝结构的可 能变化，共聚焦显微镜被用于观察免疫荧光。成像显示，经c50处理，出现空 泡化表型的细胞中，波形蛋白网络发生了显著重组。在对照细胞中，波形蛋白 丝以平行于细胞纵轴的束状结构排列，在细胞外围区域和细胞远端比中心区域 富集。在经过c50处理的细胞中，波形蛋白细丝回缩并形成了一个复杂的蜂窝 网状结构，该结构将囊泡包裹在核周区域中(图1，a，左图)。为了排除这 种改变并非是波形蛋白特异的，我们还检测了u87胶质瘤细胞中与波形蛋白同 属iii型中间丝家族的另一个蛋白，gfap。我们观察到该中间丝蛋白没有结构 变化(图1，a，右图)。因此，c50引起的细胞表型改变与波形蛋白中间丝 空间分布改变之间存在特定的联系。[0182]我们进一步评估了c50引起的波形蛋白丝的结构变化是否影响到其蛋白 功能。鉴于囊泡被限制在波形蛋白网络内，提示化合物c50可能对波形蛋白的 流动性有影响。我们利用光漂白后的荧光恢复(frap)技术来量化波形蛋白??gfp在经过或不经过化合物c50处理的细胞中的二维横向扩散。确实，在经 过c50处理的细胞中，在0.5μm直径的环状的光漂白区域中恢复荧光所需的时 间显著延迟(图1，b和c)，这表明与c50结合的波形蛋白的流动性降低或 刚性增加，因此阻碍细胞内囊泡的转运和进一步处置。[0183]总之，均三嗪衍生物c50与波形蛋白结合改变了该中间丝的组织形式并降 低了细胞内波形蛋白丝的流动性。[0184]实施例2：与波形蛋白结合的均三嗪衍生物，例如c52，抑制内吞作用和 内体转运[0185]材料和方法[0186]转染：将hek293t细胞(购自中国科学院典型培养物保藏中心，上海) 接种到96孔板中，过夜培养后达到约70％汇合度。根据制造商的手册，使用 lipomax(invitrogen)，每孔用0.6μgpmax-gpf(lonza)质粒dna转染 细胞。[0187]在转染的整个过程之前，之后或之中，将化合物c52添加到培养基中，以 测试其对脂质体转染效率的抑制作用。下表中描述了详细的时间点。[0188][0189][0190]以0.01、0.0316、0.1、0.316、1、3.16、10μm的浓度测试c52。每种处 理均在6个重复的孔中进行(n＝6)。转染后4小时除去含有转染试剂的培养 基，并用新鲜培养基代替。然后将培养板置于incucyte system(埃森生物科学 公司)中，在10倍物镜下进行实时成像。每2小时捕获每个孔的荧光强度(gfp 信号)。48小时后，测定细胞中荧光素酶的活性。[0191]结果与结论[0192]为了区分化合物c52影响哪些细胞过程，进行了脂质体介导的转染。在转 染过程的不同时间段，转染过程的之前，之后或整个过程中，用化合物处理细 胞，这代表进入阶段(胞吞作用)，脱膜阶段(内体转运)以及整个过程。当 在整个转染过程中存在化合物c52时，c52处理的细胞中gfp荧光强度的增 加速率要比溶媒处理的细胞(0μm)慢。c52对gfp表达的抑制作用在0.01 至0.316μm的剂量范围内呈剂量依赖性(图2，a)。在0.316μm时可达到 约50％的最大抑制率，并在0.316至10μm之间保持最大抑制率。在转染后4 小时用化合物c52处理细胞时，gfp表达的抑制在0.316μm时达到最大约40 ％，在0.316和10μm之间仅略有增加(图2，b)。仅在感染前用化合物c52 处理细胞时，gfp在0.316μm处的抑制率约为15％，并在10μm时进一步 增加至最大值约40％(图2，c)。[0193]从结果来看，化合物c52可以有效地抑制脂质体介导的转染，最大抑制率 约为50％，这主要是通过抑制内体转运，和较少程度的抑制内吞。化合物c52 抑制内吞作用，内体转运和整个过程的ec50分别为98、82和45nm(图2，d)。[0194]实施例3：与波形蛋白结合的均三嗪衍生物，例如c45，c52，c69a，c69b 和c52m，都能抑制肝癌细胞外泌体的释放[0195]材料和方法[0196]细胞：从jcrb细胞库获得肝癌细胞系huh7，并用补充有10％胎牛血清(fbs)，青霉素(100u/ml)和链霉素(100ug/ml)的dmem培养基培养。 当来自细胞培养的上清液需要进行外泌体纯化时，所有培养基中的fbs都会被 已清除了外泌体的fbs替代(evomic science，sunnyvale，ca)。[0197]慢病毒：外泌体报告质粒plenti-pgk-luc-exo由evomic science科学家构 建。按照公司标准规程，在293t中生产了高滴度的慢病毒颗粒。用该 plenti-pgk-luc-exo慢病毒颗粒以moi 10：1感染huh7细胞系过夜。三代后， 稳定转染的细胞用于分离培养上清液中的外泌体。外泌体中的萤光素酶活性用 于定量上清液中的外泌体。[0198]药物治疗：化合物c52，c69a，c69b，c45和c52m溶于dmso制成储 备溶液(10mm或20mm)。将带有plenti-pgk-luc-exo的huh7细胞系接 种到96孔板(透明的白色或黑色)中，过夜生长至90％融合。用指定浓度的 化合物处理细胞。已知的抑制外泌体释放的化合物gw4869(#d1692，sigma， st louis，mo)用作阳性对照以确保实验质量。用0.1％dmso处理的细胞作 为阴性对照。处理两天后，分别收集96孔板中每个孔的上清液。此时，将96 孔板上的细胞与细胞培养基中的10％prestoblue细胞活力试剂(thermofisherscientific，santa clara，ca)一起孵育30分钟。通过在tecan infinite m100 (tecan，加利福尼亚州圣何塞)中测量荧光来评估每个孔中的细胞生存量。[0199]使用exohtptm平台筛选外泌体释放抑制剂：收集每个孔中的上清液(约 98μl)，然后在300g离心10分钟以除去细胞，然后在2200g离心30分钟以 除去凋亡小体和大的细胞外囊泡。经过处理的上清液通过evomic science的 exoeztm外泌体分离试剂盒(#exocc50，加利福尼亚州桑尼维尔)用于分离 外泌体。简要地说，将80μl处理过的上清液分别与40μl缓冲液p1，40μl缓 冲液p2和1μl缓冲液d和f充分混合。充分混合后，将上清液在2200g，4℃ 下离心30分钟。除去上清液(140μl)后，将140μl的洗涤缓冲液w添加至 外泌体，然后以2200g的速度离心10分钟。除去140μl上清液后，将外泌体 沉淀充分悬浮在130μl pbs中。用promega renilla荧光素酶测定试剂盒(# e2810，麦迪逊，威斯康星州)在tecan infinite m100(tecan，美国圣何 塞)中测量50μl外泌体悬液中的荧光素酶活性。[0200]结果与结论[0201]细胞存活：用化合物gw4869，c52，c69a和c45处理两天后，肝癌 huh7-nc12的生存率约为90％(图3，a)。但是，用c69b和c52m处理细 胞，在浓度超过3160nm时huh7-nc12出现明显的细胞毒性(生存率小于30 ％)。这些数据表明，即使在高浓度(》3160nm)下，化合物c52，c69a和 c45也没有毒性，而在高浓度(》3160nm)下，化合物c69b和c52m对 huh7-nc12细胞具有细胞毒性。[0202]外泌体释放：当huh7-nc12用各种化合物处理时，上清液中的外泌体使 用exoeztm外泌体分离试剂盒(evomics)进行纯化，然后通过测量荧光素酶 活性进行定量。使用已知的外泌体释放抑制剂gw4869作为阳性对照。如图3 (b)所示，所有化合物均具有抑制外泌体释放的能力。外泌体抑制显示出剂 量依赖性。特别地，c52抑制外泌体释放的水平与已知的外泌体抑制剂gw4869 相当，而c69a和c45的抑制作用较gw4869更强。[0203]实施例4：与波形蛋白结合的均三嗪衍生物，例如c52，在体外能抑制不 同类型癌细胞释放外泌体[0204]材料和方法[0205]人非小细胞肺癌a549细胞和人胰腺癌panc-1细胞，购自中国科学院干 细胞银行(中国上海)。将细胞在含有10％胎牛血清(sigma，美国)，100u 青霉素和100μg/ml链霉素(美国gibco)的rpmi1640培养基(含有5％co2 的潮湿环境)中，于37℃培养。[0206]外泌体的纯化，表征和分析：为了从细胞培养上清液中纯化外泌体，将细 胞在补充有10％无外泌体fbs的dmem培养基中培养3天，该培养基使用常 规fbs通过在120,000g下超速离心16小时制得。收集细胞培养上清液，并在 500g离心5分钟，然后在2,000g离心20分钟以去除死细胞和细胞碎片。然 后，通过12,000g离心30分钟除去大囊泡。通过将上清液在110,000g下超离 心70分钟(backman ti70)，沉淀粗制外泌体，用pbs洗涤并过滤(0.2μm)。 然后将沉淀悬浮并再次以110,000g超离心70分钟。所有超速离心均在4℃下 进行。使用配备有蓝色激光(405nm)的lm10纳米颗粒追踪系统(nanosight) 分析了外泌体的大小和数量。[0207]透射电子显微镜(tem)观察：由培养上清液制备的外泌体的形态通过透 射电子显微镜(tem)观察。将外泌体沉淀在2％戊二醛中于4℃固定过夜。 将一滴10μl外来体悬浮液加载到formvar/carbon涂层的tem铜网上，静 置20分钟。排出过多的液体。将样品用1％乙酸铀酰固定5分钟，用双蒸馏水 洗涤8次，并在白炽灯下干燥10分钟，然后用tecnai g2 spirit bio twin透射 电子显微镜检查(fei，美国希尔斯伯勒，工作电压为120kv)。[0208]结果和结论[0209]人非小细胞肺癌a549细胞和人胰腺癌panc-1细胞经化合物c52处理后， 我们对细胞培养上清液中的外泌体进行了纯化和定量。使用经典的外泌体纯化 方法，通过三轮离心，我们获得了具有典型盘状结构形态的外泌体，其直径范 围为50-150nm(图4，a)。纳米跟踪分析表明，用化合物c52处理过的a549 细胞和panc-1细胞的培养上清液中的外泌体显著减少(图4，b和c)。western 印迹也证实了化合物c52处理导致制备的外泌体样品中外泌体标记物含量显 著减少(图4，d，左图；e；f，左图；和g)。相反，化合物c52处理并未 降低细胞内外泌体水平(图4，d，右图；和f，右图)，表明化合物c52阻 断了外泌体从细胞的释放，而不是阻止了外泌体在细胞内的产生。[0210]实施例5：波形蛋白控制外泌体生成与释放；与波形蛋白结合的三嗪衍生 物，例如c52，抑制人脑胶质瘤细胞中波形蛋白介导的外泌体释放[0211]材料和方法[0212]crispr设计和波形蛋白基因编辑：质粒 pb-tre-nls-linker-cas9-zf-ires-hrgfp-blasticidin用于强力霉素诱导的人密 码子优化的cas9的表达，质粒pgl3-u6-2sgrna-ccdb-ef1a-puromycin用于波 形蛋白基因特异性sgrna的表达。借助crispr设计工具(http://crispr.mit.edu/)， 设计了两条引导链，靶向人波形蛋白基因外显子1(exon 1)的两个片段(靶 位点1：gtcctcgtcctcctaccgc，seq id no:1；靶位点2： cgggctcctgcaggactcgg，seq id no:2)。sgrna编码序列被克隆到 bsmbi位点的sgrna表达载体中。表达cas9的质粒通过lipofectamine 2000 (invitrogen)转染u87细胞，并经blasticidin筛选。稳定的细胞系用doxycycline 处理12小时以诱导cas9表达，然后用表达波形蛋白sgrna的载体转染，并 在24小时后用puromycin选择转导细胞。收集合并的克隆细胞。分别通过pcr (敲除：正向引物atgttcggcggcccgggcac(seq id no:3)，反向引 物aggagccgcaccccgggcacg(seq id no:4)；对于野生型：正向引 物gaggggaccctctttcctaa(seq id no:5)，反向引物 ggtggacgtagtcacgtagc(seq id no:6))和western blotting确认靶 基因区域的缺失和波形蛋白的缺失。[0213]蛋白质印迹：收集来自不同条件培养的外泌体，并通过经典的差速离心方 案纯化，然后用含pmsf的ripa缓冲液(碧云天生物技术，上海，中国)裂 解。离心除去裂解物以除去不溶物。蛋白的浓度通过增强型bca蛋白测定试 剂盒(碧云天生物技术，上海，中国)确定。取40μg蛋白质通过十二烷基硫 酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离，并将其转移到聚偏二氟乙烯膜 (merck millipore)上。将膜用5％牛奶封闭1小时，然后与一抗在4℃孵育过 夜。将膜洗涤3次，然后在室温下与二抗孵育1小时。通过gel imaging system (bio-rad，美国)检测条带，并通过image j测量。使用的主要抗体是兔抗β??肌动蛋白，gaphd，cd63，cd9，tsg101和波形蛋白(abcam，英国)。[0214]结果和结论[0215]为了确定c52对外泌体释放的阻滞是否是其与波形蛋白结合的直接结果， 我们尝试使用crispr-cas9系统从人神经胶质瘤u87细胞中敲除波形蛋白基因。 我们没能获得vim-/-克隆，所得到克隆都是vim+/-，只有一个等位基因被敲 除。缺乏可存活的vim-/-克隆可能表明波形蛋白在这种特定的癌症类型中起着 关键作用。western印迹显示，与u87 vim+/+细胞相比，u87 vim+/-细胞的细 胞内波形蛋白含量较低(图5，a和b)，相应地，细胞内的外泌体含量也较 低(图5，c-e)，表明波形蛋白促进细胞内外泌体的形成。c52处理不会降低 u87 vim+/+细胞或u87 vim+/-细胞胞内的外泌体标记物cd9的量(图5，c和 d)，也不会降低u87 vim+/+细胞胞内的外泌体标记物cd63的量(图5，c 和e)。这些结果表明，与波形蛋白敲低不同，c52处理不会减少细胞内尚未 外排的外泌体(或ilv)的数量。蛋白质印迹(图5，f)和定量(图5，g和 h)显示，与u87 vim+/+相比，波形蛋白敲除和c52处理均减少了外泌体标记 物cd9和cd63的水平(图5，f-h)，在波形蛋白敲低的u87 vim+/-细胞中， 化合物c52处理导致该细胞培养液中的cd9进一步减少(图5，f和g)。这 些结果表明，与波形蛋白结合的化合物c52主要阻断外泌体从细胞内向细胞外 的释放。[0216]实施例6：与波形蛋白结合的化合物c52显著抑制癌细胞的体外的迁移和 浸润生长，并减少小鼠血液中的外泌体[0217]材料和方法[0218]伤口愈合分析：将细胞接种在含有完全培养基的6孔板中，并在37℃，含 5％co2的湿润空气环境中培养。细胞达到90％汇合后，使用200μl塑料移液 管吸头形成垂直伤口。然后，将细胞用pbs洗涤3次，然后与含有不同浓度 c52的无血清rpmi-1640培养基孵育24小时。使用相差显微镜来拍摄伤口区 域和伤口区域内的迁移细胞。使用image j软件测量伤口面积。[0219]细胞浸润生长检测：将悬浮在100μl无血清rpmi-1640培养基中的1×?104细胞接种到预先涂有matrigel，并添加dmso或c52的6孔transwell的每 个上腔室中(cat.3422，corning，ny，usa)。在不同的浓度。将含有10％ fbs的600μl rpmi-1640添加到每个孔的底部腔室中。将transwell板中的细 胞培养24小时。用润湿的棉签轻轻擦拭上表面细胞，而将穿过基质胶到达膜 下表面的细胞用多聚甲醛固定并用0.1％的结晶紫染色。这些在下表面的细胞 被认为是侵入性的，并在倒置显微镜下在5个随机视野中计数。通过image j 软件计算侵袭性细胞的数量。[0220]体内实验：6至8周龄的balb/c小鼠(18至20g)购自北京生命河实验 动物技术有限公司(中国北京)，并饲养在南京中医药大学实验动物中心。将 动物维持在22±2℃，12小时/12小时有规律的明暗循环，可以自由获取食物和 水。所有动物实验均经南京中医药大学伦理委员会批准。根据iacuc批准的 准则提供动物护理。[0221]每组三只小鼠每天连续14天每天接受一次100mg/kg的c52或相同体积 的溶媒。最后一次给药后24小时，小鼠在用戊巴比妥钠麻醉下，从中采集血 样，然后对小鼠实施安乐死。通过蔗糖密度梯度离心制备血浆外泌体，并通过 western印迹进行分析。[0222]从小鼠血浆中分离外泌体：为了获得用于外泌体分离的血浆，将血液在4 ℃下以500g离心5分钟；2000g 15分钟；并以10000g的溶液处理20分钟， 以去除细胞，碎片和大囊泡。将粗制外泌体沉淀重悬于60ml的冷pbs (invitrogen)中，然后将外泌体悬浮液在100,000g下于4℃离心70分钟。对 于蔗糖密度梯度离心，将洗涤过的外泌体沉淀物与2ml的2.5m蔗糖溶液混 合，加入蔗糖阶跃梯度柱内(从2m到0.4m的10个2ml蔗糖梯度，使用20 mm hepes作为稀释剂)。将该蔗糖阶跃梯度在200,000g(backman ti70)4 ℃离心16h。收集级分，并在4℃下于100,000g的冷pbs中再离心70分 钟。将所有级分沉淀物重悬于30μl裂解缓冲液中，然后进行进一步的蛋白质 印迹分析。[0223]结果和结论[0224]众所周知，波形蛋白可促进细胞迁移，而外泌体可增加细胞迁移率(ivaska, j.et al.，novel functions of vimentin in cell adhesion,migration,and signaling. exp.cell res.313,2050-2062,2007；hoshino,a.et al.(2015).tumour exosomeintegrins determine organotropic metastasis.nature 527,329-335，2015)，我们研 究了与波形蛋白结合的化合物是否会影响癌细胞的迁移和侵袭。伤口愈合试验 显示，在肺癌a549细胞(图6，a)和胰腺癌panc-1细胞(图6，b)中， 经c52处理后，间隙大小的闭合率随时间显著降低，并具剂量依赖性关系。 transwell分析表明，c52阻碍了细胞针对两种癌症类型的迁移能力，与a549 细胞(图6，c)相比，panc-1细胞(图6，d)更为明显。由于panc-1细 胞迁移的速度比a549细胞快，因此与波形蛋白结合的化合物c52对更具侵袭 性生长的癌细胞具有更大的抑制作用。物。[0237]实验设计：在每个治疗组(预防和治疗)中评估40只动物，每个剂量组 10只。请参阅下表。[0238][0239]步骤：在预防组中，在感染前-15和-5h将c52给予小鼠。从感染后24小 时开始，在感染后每天大约同一时间qd给予后续剂量。通过管饲法给药。在 治疗组中：从感染后24小时开始向小鼠施用c52。感染后每天大约在同一时 间qd给予后续剂量。通过管饲法口服灌胃给药。[0240]监测感染的程序包括(1)每日临床评估和评分，包括体重和疾病评分， 以及(2)麻醉后存活的动物持续至实验终点。[0241]备注：由于多数小鼠体重持续减轻且疾病评分增加，因此在感染后5天对 所有的动物都实施安乐死。安乐死通过吸入异氟烷(滴入法)和开胸手术进行， 并摘取了重要器官(肺)。取肺组织用于进一步评估。取血清用于可能的下游 分析。[0242]结果与结论[0243]虽然模拟感染的小鼠(g1)保持稳定的体重(±3％以内)，但所有 sars-cov-2感染的小鼠(g2至g8)在研究过程中均表现出不同程度的体重 减轻(图8，a和c)。在溶媒组(g2)与预防组(g3，g4，g5)或治疗组 (g6，g8)之间体重减轻没有显著差异。但是，在治疗组中，接受c52剂量 为10mg/kg的小鼠(g7)的体重减轻明显少于溶媒组(g2)。[0244]正如预期的那样，模拟感染组(g1)的所有小鼠均未出血，而感染溶媒 组(g2)的所有小鼠均有较严重的出血。感染预防组(g3，g4，g5)小鼠的 出血的严重程度似乎不如溶媒组(g2)。尽管在中、低剂量组(g3，g4)每 组中都各有一只小鼠没有出血，但与溶媒组(g2)相比，组间差异无统计学显 著性。在感染治疗组中，低剂量和中剂量(g6，g7)的出血程度均显著低于 溶媒组(g2)，而高剂量治疗组(g8)与溶媒组(g2)之间的组间差异不显 著(图8，b和d)。[0245]总之，sars-cov2感染后24小时口服低剂量(3mg/kg)和中剂量(10mg /kg)的化合物c52可显著减少小鼠肺出血。中剂量的c52的治疗也显著改善 了体重的减轻。[0246]应当理解，前述内容描述了本发明的优选实施例，并且可以在不脱离权利 要求书所阐述的本发明的精神或范围的情况下对其进行修改。为了特别指出并 清楚地要求保护被视为发明的主题，以下权利要求总结了本说明书。