肿瘤相关成纤维细胞促进原代胰腺癌细胞生长及人源性异种移植瘤模型体内成瘤

　　胰腺癌，尤其是胰腺导管癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC），作为最致命的恶性肿瘤形式之一，其占比约 90%，病情进展迅速，病死率极高，被医学界誉为“癌症之王”[-]。当 PDAC 一旦确诊，大多数已无法手术切除，即便少数（不到 20%）适于手术治疗，最终多数患者还是会死于转移性癌，因此，以化疗为核心的辅助治疗成为 PDAC 治疗的关键[-]。然而不同患者对化疗药物的反应不一，化疗普遍耐药，整体疗效并不理想[]。肿瘤个体化药物治疗的实现很大程度上依赖于高效药物敏感性的检测，但目前临床尚缺乏有效的可靠检测方法，尤其是 PDAC[]。首先，原代 PDAC 细胞培养成功率比较低，构建个性化人源 PDAC 细胞库困难；其次，现有人源性异种移植瘤（patient-derived xenograft，PDX）模型具有明显的局限性[-]，如建模成瘤率及稳定传代率较低，建模评价周期长（半年以上），在临床应用受到极大限制[-]。上述问题突显了 PDAC 个体化药物敏感性筛查研究的复杂性及艰巨性，反映了对于 PDAC 治疗耐药机制以及药物筛选系统认识不足的客观现实，亟需更全面、多角度的研究进行揭示。肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）是 PDAC 肿瘤微环境中非常重要的间质成分，其对 PDAC 的发生、发展、转移甚至耐药具有至关重要的促进作用[-]。但目前相关研究[, -]主要运用已建成的 PDAC 细胞系，而 CAFs 对于原代 PDAC 细胞培养以及 PDX 模型构建是否有促进作用鲜见报道。本研究拟通过优化人原代 PDAC 细胞及 CAFs 分离培养方法，以验证 CAFs 对原代 PDAC 细胞的体外生长以及其对高度免疫缺陷模型 NOG 小鼠体内成瘤的影响，以探索 PDAC PDX 模型构建新方法。

　　高糖培养基（DMEM-H），美国 Sigma 公司；胎牛血清，以色列 BI 公司；0.25% 胰蛋白酶和抗生素均为 Gibco 公司。

　　采集四川大学华西医院胰腺外科 2015 年 1 月至 2017 年 6 月期间的 15 例手术切除后冰冻切片病理证实的 PDAC 标本，置于预冷无菌液（DMEM-H 含 1% 青霉素链霉素双抗，0.1% 胎牛血清）中，冷藏冰盒运送至实验室。所有标本采集均得到四川大学华西医院伦理委员会的批准并签署患者知情同意书。患者男 9 例，女 6 例；年龄 45～70 岁。

　　清洗（DMEM-H 含 1% 青霉素链霉素双抗，0.1% 胎牛血清）组织块 3 次，去除血块及脂肪组织，再用手术刀片充分切碎至体积 0.5～1.0 mm3 见方的小组织块，再次清洗去除脱落细胞。用镊子将组织块逐块放入无菌培养皿，组织块间距约 0.3 cm，吸净液体后置于 37 ℃、5% CO2 培养箱 2 h，待其贴壁牢固后加入少量培养液静置培养。1～2 d 后首次换液，以后每 2～3 d 换液，待组织块周围长满细胞后去除组织块继续培养细胞。

　　待混合生长的原代 PDAC 细胞及 CAFs 基本铺满时，胰蛋白酶液消化传代。自第 2 次传代起，根据 CAFs 与原代 PDAC 细胞生长速度及贴壁能力的差异，用酶差速消化法联合差速贴壁法分离纯化 CAFs 及 PDAC 细胞，主要步骤如下：① 混合生长的原代培养细胞去培养液后 PBS 洗涤，加入约 1～2 mL 胰蛋白酶液室温消化 1～2 min 后，在显微镜下可见长梭形 CAFs 变为椭圆形并逐渐从培养皿底部脱落，而原代 PDAC 细胞对胰蛋白酶消化反应差（5～6 min），仍贴壁于培养皿（、）。② 此时加入含有胎牛血清的 DMEM 液中止消化，吸取细胞悬液离心，培养基重悬细胞后转移至另一无菌培养瓶中，于 37 ℃、5% CO2 培养箱静置 15 min 待 CAFs 贴壁后，在显微镜下可见 CAFs 已开始贴壁牢固且细胞伸展铺开，而混杂的原代 PDAC 细胞仍然呈圆形悬浮状，此时弃去培养液，再次加入培养基洗涤 2 遍，去除混杂的 PDAC 细胞，贴壁的纯化 CAFs 细胞加培养基继续培养（、）。③ 将前述第 ① 步培养皿中未充分消化的原代 PDAC 细胞用 PBS 洗涤 2 次，再次加入胰蛋白酶液 1～2 mL，彻底消化 PDAC 细胞 4～5 min 后，再用含有胎牛血清的 DMEM 培养液终止消化，离心、重悬细胞后转移至另一无菌培养瓶中，于 37 ℃、5% CO2 培养箱静置 30 min， 待 CAFs 贴壁，显微镜下可见 PDAC 细胞仍然呈圆形悬浮状，而混杂的 CAFs 已开始贴壁牢固并细胞伸展铺开，将未贴壁的 PDAC 细胞悬液转移至新培养瓶继续培养。将纯化后的细胞（第 ② 步获得的 CAFs，第 ③ 步获得的 PDAC 细胞）继续培养，此后每 3～5 d 同法进行纯化、传代 1 次。传代 3 次左右即可得到纯化的 CAFs 以及 PDAC 细胞。

　　将纯化后的原代 PDAC 细胞及 CAFs 分别接种于 8 孔可移除插件培养载玻片（德国 Ibidi 公司），培养 24 h 后弃去培养液，PBS 洗涤后 4% 多聚甲醛固定 10 min，PBS 清洗后山羊血清封闭液（含 0.3% Triton X-100）室温孵育 1 h，随后按 1∶400 加入如下兔抗人一抗（均为美国 Abcam 公司）：波形蛋白（vimentin）或细胞角蛋白（CK-19）或 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），4 ℃ 过夜孵育。次日 PBS 清洗，再分别加入稀释后的荧光标记的二抗 37 ℃ 避光孵育 1 h。PBS 洗涤后常规 DAPI（Sigma 公司）染核，玻片用抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜观察蛋白表达情况。

　　将混合培养的原代 PDAC 细胞及 CAFs 采用酶差速消化法联合差速贴壁法分离并计数细胞后分别培养，即原代 PDAC 细胞、CAFs 及混合培养细胞（原代 PDAC 细胞+CAFs）培养。当细胞达到 80%～90% 融合时，胰酶消化并细胞计数，混悬于 Matrigel 基质胶，然后分别将原代 PDAC 细胞、CAFs 及混合细胞（2∶1）按细胞数量为 1×106/只注射于 NOG 小鼠肩胛部皮下，观察其成瘤情况，从第 2 周开始，每 2 周测量 1 次肿瘤体积，连续测量 8 周并绘制肿瘤生长曲线。

　　使用 IBM SPSS Statistics 25 软件包对数据进行分析。计数资料使用 χ2 检验，计量资料使用独立样本 t 检验。检验水准 α=0.05。

　　PDAC 组织块原代培养最快 5～7 d 即可见细胞从组织块周边长出，然后不断地向四周扩散铺开，此时成纤维样细胞和上皮样细胞混杂存在。上皮样细胞成团分布，成纤维样细胞围绕上皮细胞成放射状排列（、）。15 例 PDAC 患者的标本，除 1 例患者的 PDAC 组织块贴壁培养 10 d 仍无细胞长出外，其余 14 例患者的 PDAC 组织块均成功培养出细胞，并且均成功细胞传代。

　　采用 vimentin、CK-19、α-SMA 免疫荧光可鉴定分辨所培养的原代 PDAC 细胞及 CAFs。CK-19 阴性而 vimentin 阳性，表明其为间质来源，证实为 CAFs，且 α-SMA 阳性为 CAFs 特异性蛋白，进一步验证了其为 CAFs（-）；CK-19 阳性而 vimentin 阴性，表明其为上皮来源，证实为原代 PDAC 细胞（-）。

　　原代 PDAC 和 CAFs 共培养（），在传代过程中 PDAC 细胞呈鹅卵石样贴壁生长，形态饱满，折光度好，可分散生长。按原代 PDAC 细胞∶CAFs为 2∶1 的比例共培养，细胞生长活性最好，体外培养至第 10 代，生长活性仍无明显减弱。与 CAFs 分离后，单独培养的原代 PDAC 细胞（）在传代过程中形态学从之前的鹅卵石样贴壁生长逐渐变得扁平，折光度下降，生长缓慢，并且贴壁能力明显减弱，最终失去贴壁能力停止生长，多数在传至 5 代以内停止生长，其中第 2 代停止生长者 2 例，第 3 代停止生长者 3 例，第 4 代停止生长者 5 例，第 5 代停止生长者 4 例。结果提示，CAFs 共培养对原代 PDAC 细胞适应新环境的生长可以起到促进作用，说明混合培养法（混合培养法是将原代 PDAC 细胞及 CAFs 按细胞比例共培养）有助于提高原代 PDAC 细胞培养成功率。

　　NOG 小鼠体内注射原代 PDAC 细胞可成功建立 PDX 模型（），经过 HE 染色病理（）证实，此法构建的 PDX 模型的肿瘤组织病理特征与 PDAC 患者的组织病理特征（）相似；NOG 小鼠体内单独注射 CAFs 无肿瘤形成；NOG 小鼠体内注射原代 PDAC 细胞及混合细胞（原代 PDAC 细胞+CAFs）建模 2～3 周即可形成肿瘤。原代 PDAC 细胞及 CAFs 培养成功的 14 例均用于 NOG 小鼠体内注射构建 PDX 模型，混合细胞注射法构建的 PDX 模型有 13 例（92.9%）成瘤，单一肿瘤细胞注射法构建的 PDX 模型有 9 例（64.3%）成瘤，可能因样本量过少，二者间成瘤率比较差异无统计学（χ2=1.909，P=0.167）。经连续测量，肿瘤细胞注射后 2、4、6、8 周时混合细胞注射法建模者的肿瘤体积均明显大于单一肿瘤细胞注射法建模者对应观察时间点的肿瘤体积，二者比较差异均具有统计学意义（P<0.01），见。

　　在当前多学科诊疗模式下，以化疗为核心的辅助治疗对改善 PDAC 预后起到了至关重要的作用[, -]。然而 PDAC 患者普遍耐药，整体疗效极不理想，其原因见前言介绍。

　　原代肿瘤细胞比细胞系更加近似患者肿瘤，原代肿瘤细胞保留了原肿瘤的关键遗传特性，还可模拟原始肿瘤的行为。大量研究[-]证实，肿瘤细胞原代培养的遗传突变与对应肿瘤活组织标本中的突变高度匹配，继承了来源肿瘤的基因组特征。2014 年底首次报道在实验室利用来自于转移性前列腺癌患者的活检组织培育出三维肿瘤类器官，开启了肿瘤个体化治疗新纪元[]。紧接着冷泉港实验室也成功培育 PDAC 类器官模型[]。基于以肿瘤类器官研究为代表的最新研究成果有望构建以廉价、快速和适宜高通量为特点的新兴药物筛选系统，为我们提供了更真实的环境来同时测试新的和现有的药物以及探讨联合疗法[-]，这是迈向个性化精准医疗的一个重要步骤，正如奥巴马总统提议的新的精准医学所述，在未来，反映患者个体独特生物学的器官模型可用于药物筛选。由此可见，建立 PDAC 活体生物银行、完善并丰富现有的 PDAC 生物信息库，是通向个体化疗法抗击肿瘤的新途径，将为探寻肿瘤的信号通路及寻找新的药物靶点的强大新型工具[-]。然而现有 PDAC 类器官培育技术尚不成熟，培育条件培养液所需蛋白因子数量众多，技术要求高，成本高昂，难以推广应用。

　　肿瘤与邻近细胞（肿瘤微环境）的相互作用对它的生物学行为至关重要[]。有研究[]表明，肿瘤与间质细胞共培养体系较单一肿瘤细胞培养体系在肿瘤遗传发育、侵袭、转移等方面更能真实地反映肿瘤的生物学特性。CAFs 是 PDAC 组织中的主要间质细胞，在促进 PDAC 进展、转移以及诱发耐药方面起了关键作用[-]。因为传统方法原代 PDAC 细胞培养成功率低，本研究在原有方法基础上进一步优化采用 CAFs 与原代 PDAC 细胞混合培养法，以期望提高原代 PDAC 细胞培养成功率，研究结果证实，CAFs 对原代 PDAC 细胞适应培养环境的生长起到明显的促进生长作用，且原代 PDAC 细胞与 CAFs 共培养法可显著提高原代 PDAC 细胞稳定传代成功率。

　　组织块贴壁长出法、酶消化法是分离获取原代细胞常用方法[-]。酶消化法使用的胶原酶等消化酶可对组织细胞（特别是 CAFs）造成损害，导致细胞活性下降；此外，酶消化法所得细胞混杂难以纯化，适合对细胞纯度要求不高的实验研究或者模拟肿瘤微环境研究，比如三维培育肿瘤类器官通常采用酶消化法[]。结合前期胰腺成纤维细胞培养经验及细胞学特性，本研究采用组织块贴壁长出法培养原代 PDAC 细胞及 CAFs，辅以含有生长因子的条件培养液，原代细胞培养成功率高。组织块长出法可发挥组织细胞的旁分泌效应，促进细胞生长[]。与此同时，组织块长出法相对较经济，仅需较少的组织块便可进行细胞原代培养，适合于腔镜或内镜取材的小块组织。

　　目前普遍认为 CAFs 具有促进 PDAC 细胞增值、抗凋亡等多种肿瘤协同作用。基于此，本研究将原代 PDAC 细胞与 CAFs 共培养，以提高原代 PDAC 细胞的培养成功率，结果表明，CAFs 共培养对原代 PDAC 细胞适应新环境的生长可以起到促进作用，共培养法有助于提高原代 PDAC 细胞培养成功率。将原代 PDAC 细胞与 CAFs 共培养有助于通过旁分泌效应及接触作用发挥肿瘤-间质相互作用，促进细胞增殖生长，确切机制有待进一步研究证实。

　　基于 CAFs 共培养对原代 PDAC 细胞生长的促进作用，本研究进一步探索混合细胞（原代 PDAC 细胞+CAFs）注射法构建 PDX 模型的优势，结果显示，此法构建的 PDX 模型肿瘤病理特征与临床样本相似；混合细胞（原代 PDAC 细胞+CAFs）法较肿瘤细胞单一法成瘤更早及建模成功率更高，与新近 Ehrenberg 等[]报道的成功率接近，PDAC 为 86.3%（19/22）。对于混合注射法中 CAFs 在 NOG 小鼠体内去向以及其通过何种机制促进原代 PDAC 细胞体内增殖并进而致瘤仍需深入研究，我们推测混悬于 Matrigel 基质胶中的混合细胞（原代 PDAC 细胞+CAFs）可能更有助于形成利于肿瘤细胞增殖生长的微环境。

　　重要声明

　　利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。

　　作者贡献声明：陈拥华、刘续宝负责实验设计；陈拥华实施原代细胞培养体外试验及移植瘤模型构建；李程负责实验动物及移植瘤测量；陈拥华、梁艳、周利、杨桢同时负责 HE 病理切片、免疫荧光染色及图像处理。

　　伦理声明：本研究通过了四川大学华西医院临床试验与生物医学伦理专委会审批（批文编号：2014 年 审（37）号）。

　　致谢：感谢四川大学华西医院胰腺外科对本研究的大力支持！四川大学华西医院公共实验技术中心张杰高级实验师提供的技术指导和帮助。