细菌组合物及其应用方法与流程

　　本发明涉及细菌组合物及其应用方法。

　　背景技术：

　　：：哮喘是儿童中最常见的慢性疾病，在全球范围内影响着2.35亿人1。哮喘患病率在发达国家和发展中国家之间的显着差异2突出了环境因素的影响，包括改变早期的微生物暴露和促进免疫超敏反应发展的婴幼儿期的饮食和抗生素的使用3。最近在小鼠中的研究涉及了一种生命早期“关键窗口期”，其中的肠道微生物变化(生态失调)是对免疫发展和实验性哮喘影响最大的因素4。肠道微生物和肠道微生物衍生的化合物(包括短链脂肪酸(scfa))的变化，已在多种疾病5包括哮喘6中涉及，虽然目前还不清楚这些变化是否先于哮喘的发生，以及它们是否参与了人类的哮喘。技术实现要素：本发明部分地提供了细菌组合物和它们的应用方法。所述细菌组合物可用于但不限于，改变肠道菌群，填充胃肠道，或者对有需要的对象诊断或治疗肠道生态失调，哮喘，过敏症或特异性反应。在一个方面，本发明提供了一种对有需要的对象治疗一种或多种肠生态失调(gutdysbiosis)，哮喘(asthma)，过敏症(allergy)或特异性反应(atopy)的方法，所述方法包括向对象给予有效量的包括两种或多种粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)或罗氏菌属(rothia)的细菌的细菌组合物。在另一方面，本发明提供了一种改变需要这种治疗的对象的肠道菌群的方法，所述方法包括向对象给予有效量的包括两种或多种粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)或罗氏菌属(rothia)的细菌的细菌组合物。在另一方面，本发明提供了一种在有需要这种治疗的对象中填充胃肠道的方法，所述方法包括向对象给予有效量的包括两种或多种粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)或罗氏菌属(rothia)的细菌的细菌组合物。在一些实施方式中，所述对象正在接受，将要接受，或已经接受了抗生素治疗。在一些实施方式中，所述对象是人胎儿，人婴幼儿，或怀孕的女性。在一些实施方式中，所述人婴幼儿不到一岁。在一些实施方式中，所述细菌组合物预防性地进行给药。在一些实施方式中，所述细菌组合物通过口服或直肠给药。在一些实施方式中，所述细菌组合物被制成液体悬浮液。在一些实施方式中，所述细菌组合物包括两种或多种普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)，多毛毛螺菌(lachnospiramultipara)，小韦荣球菌(veillonellaparvula)或粘滑罗氏菌(rothiamucilaginosa)。在一些实施方式中，所述方法包括向对象给予有效量的细菌组合物，所述细菌组合物包括三种或多种粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)或罗氏菌属(rothia)的细菌。在一些实施方式中，所述细菌组合物包括三种或多种普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)，多毛毛螺菌(lachnospiramultipara)，小韦荣球菌(veillonellaparvula)或粘滑罗氏菌(rothiamucilaginosa)。在一些实施方式中，所述方法包括向对象给予有效量的细菌组合物，所述细菌组合物包括粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)和罗氏菌属(rothia)的细菌。在一些实施方式中，所述细菌组合物包括普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)，多毛毛螺菌(lachnospiramultipara)，小韦荣球菌(veillonellaparvula)和粘滑罗氏菌(rothiamucilaginosa)。在一些实施方式中，所述给药导致对象中至少一种或多种粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)或罗氏菌属(rothia)的细菌数量的增长。在一些实施方式中，所述增长通过定量聚合酶链反应来确定。在一些实施方式中，所述增长通过检测来自所述对象的样品中的代谢物来进行监控。在一些方面，本发明提供了一种细菌组合物，包括两种或多种粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)和罗氏菌属(rothia)的细菌，以及载体。在一些实施方式中，细菌是以能有效治疗有需要的对象的肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应，或改变肠道菌群，或填充胃肠道的量存在。在一些实施方式中，细菌用于治疗有需要的对象的肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应，或用于改变肠道菌群，或用于填充胃肠道。在一些实施方式中，所述细菌大体上是纯的。在一些方面中，本发明提供了一种确定对象发展为肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应的可能性的方法，所述方法包括确定来自对象的样品中的两种或多种粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)或罗氏菌属(rothia)的细菌水平，并将该水平与参考值或健康人群的水平进行比较；其中所述细菌水平的降低表明发展为肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应的可能性。在一些实施方式中，所述方法进一步包括确定来自对象样品中的代谢物的水平的步骤。在一些实施方式中，所述方法进一步包括向发展为肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应的可能性增加的对象给予有效量的如权利要求18或19的组合物。该概要不一定描述了本发明的所有特征。附图说明图1是显示研究对象分组的示意图，其中，基于皮肤点刺试验和1岁龄的喘息数据，将319个被选择的对象分为4个临床表型。对照组，特异性反应+喘息组(aw)，仅特异性反应组，仅喘息组。基于3周岁的数据计算哮喘预测指数(api)(相对于对照组的odds用于计算各组在学龄期被诊断为哮喘的风险(与对照组相比的odds：aw，13.5[p<0.001；95％ci：3.2至57.4]；仅喘息组，2.7(ns)，仅特异性反应组，2.4(ns))。图2a是通过pca对3月龄的四个临床表型的粪便菌群进行的多变量分析。观察到四个表型的微生物群之间没有差异。图2b显示3月龄的四个临床表型的α多样性箱形图(shannon多样性指数)，其中上部和下部“四分位数”分别对应对应于第一和第三四分位数(第25和第75百分位数)。观察到α多样性没有差异。图2c显示3月龄的四个临床表型的前100个otu细菌菌群的相对丰度。对四组之间的统计分析发现，在对照组和特异性反应-喘息组(显示在柱状图的放大部分)的低丰度细菌菌群之间具有显著差异。图2d显示对aw组和随机选择的对照子集的粪便样品中选定属的细菌总16s扩增的qpcr量化，3月龄(nctrl＝20,naw＝21)，1岁龄(nctrl＝19,naw＝21)[中心值表示为平均值±s.e.m(双尾mannwhitney检验；*p<0.05，***p<0.001)。图2e显示了通过对3月龄相同的样品子集的picrust分析得到的，丰度最显著不同的30个基因(kos)的热图。热图的强度代表方差稳定的ko丰度。对对象的分层聚类基于使用完全连锁法得到的欧氏距离。图2f显示了通过对1岁龄相同的样品子集的picrust分析得到的，丰度最显著不同的30个基因(kos)的热图。热图的强度代表方差稳定的ko丰度。个体的分层聚类基于使用完全连锁法得到的欧氏距离。这一分析只能区分3月龄而不能区分1岁龄的特异性反应-喘息组与对照组。图3a显示了在3月龄的aw组和对照组的一个子集的粪便中三个最大丰度scfas的浓度(naw＝13,ncontrol＝13)，通过气相色谱法分析测定并标准化为粪便重量。图3b显示了在3月龄的aw组和对照组样品的一个子集的尿中检测的，已知微生物来源的或贡献的代谢物的相对浓度(naw＝19,ncontrol＝16)。通过超高相液相色谱-串联质谱分析法测定的，标准化为摩尔渗透压浓度的代谢组数据，以经缩放的强度来进行表示。在图的标题中每种代谢物旁的上标数字表示该代谢物参与的生化途径，如下所示：1)次级胆汁酸代谢；2)血红蛋白代谢；3)苯丙氨酸代谢；4)组氨酸代谢；5)食物组成。通过shapiro-wilk检验进行标准化。图中所示的所有统计信息基于双尾mann-whitneywilcoxon检验(如果是非正态分布)或非配对双尾t检验(如果正态分布)；中心值表示为平均值±s.e.m(*p<0.05，**p<0.01)。图4a显示小鼠(3周龄幼崽)的粪便中细菌菌群的相对丰度，该小鼠的亲本曾用3月龄aw婴儿的粪便进行接种，或以相同的样品加上下述活的细菌混合物进行接种：多毛毛螺菌(lachnospiramultipara)，小韦荣球菌(veillonellaparvula)，粘滑罗氏菌(rothiamucilaginosa)和faecalibacteriumprauznitzii(aw+flvr)。在定殖或未定殖flvr的小鼠中观察到细菌菌群组成的明显不同。图4b显示在用flvr接种的亲本所生的小鼠中，毛螺菌属(lachnospirasp.)，韦荣球菌属(veillonellasp.)，罗氏菌属(rothiasp.)和粪杆菌属(faecalibacteriumsp.)的百分比丰度的升高。图4c显示在对携带两种不同微生物菌群(aw或aw+flvr)的小鼠，3周的ova免疫方案诱导气道炎症后，其在支气管肺泡灌洗(bal)中的细胞计数。对照组小鼠用生理盐水进行免疫。图4d显示了在bal中的总细胞分类计数。星号表示在aw组和aw+flvr组中淋巴细胞(*)和嗜中性粒细胞(****)的显著减少(*p<0.05，****p<0.0001)。图4e显示了总组织病理学评分和有代表性的苏木精和伊红染色的肺切片。箭头显示接种aw的小鼠中显著炎性浸润的存在。同样的aw接种物中另外再加入flvr进行的接种，导致了炎症浸润的减少。比例尺＝300μm。图4f显示肺组织匀浆中细胞因子的浓度，通过多路复用流式微球技术(multiplexedcytometricbeadarray)进行测定，并标准化为总蛋白浓度。图4g显示通过elisa测定的血清中ova特异性的ige，igg1和igg2a的浓度。c-g)中心值是指两个独立实验的平均值±s.e.m(ncontrol＝8,naw＝18,naw+flvr＝28)。样品代表生物性重复。没有支架(bracket)的星号表示相对于对照组小鼠的显著差异(anova和tukey多重比较检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。图5显示在一周岁以内肠道微生物与宿主代谢的变化。a)通过pca对319名儿童在3个月和1周岁时的肠道菌群进行多变量分析，由permanova进行统计比较(p<0.001)。b)对319名儿童在3个月和1周岁时的肠道菌群的基因组成进行的pca(p<0.01)。c)对34名儿童在3个月和1周岁时的尿代谢物情况进行的pca(n3mo＝35,n1yr＝33)；p<0.01)。图6a显示了采用shannon多样性指数对3月龄和1岁龄的样品进行比较的α多样性，并通过双尾mannwhitneywilcoxon进行统计确认(p<0.05，显示为箱形图，上部和下部“四分位数”对应于第一和第三四分位数(第25和第75百分位数)。图6b显示由8种细菌菌群所代表的前100个otu的相对丰度，以及发生在3月龄和1岁龄的微生物群急剧转变的证据。图6c显示3月龄和1岁龄之间前10个具有统计意义上显著差异(mt检验；p<0.005)丰度的otu的热图。每个矩形代表一个测试对象。图7a显示对1岁龄的四个临床表型的肠道菌群进行的pca，以及根据表型的差异总体微生物群转变的消失。图7b显示1岁龄的四个临床表型的α多样性(shannon多样性指数)(显示为箱形图，其中上部和下部“四分位数”分别对应于第一和第三四分位数(第25和第75百分位数)。四组间未观察到差异。图7c显示1岁龄的四个临床表型的细菌菌群的相对丰度(前100个otu)。细菌类群丰度的统计分析，未在任何组之间产生显著差异。图8显示3月龄的四个临床表型前100个otu细菌属的相对丰度。图9显示1岁龄的四个临床表型前100个otu细菌属的相对丰度。图10显示通过picrust预测的kegg功能类别。在对照组和aw组的相对丰度之间，picrust预测的kegg功能类别具有显著差异(nctrl＝20，naw＝21；welcht检验，q-值<0.05)。图中显示的是类别柱状图，其中，3月龄的平均比例的差异>0.01％。图11a显示faecalibacteriumpraussnitziiatcc27766的16s核糖体rna的核酸序列，genbank登录号x85022.1(seqidno：1)。图11b显示faecalibacteriumpraussnitziiatcc27768的16s核糖体rna的核酸序列，genbank登录号aj413954.1(seqidno：2)。图11c显示多毛毛螺菌(lachnospiramultipara)的部分16s核糖体rna的核酸序列，模式菌株dsm3073t，genbank登录号fr733699.1(seqidno：3)。图11d显示小韦荣球菌(veillonellaparvulaatcc10790)菌株的16s核糖体rna基因的核酸序列，ncbi参考序列nr_043332.1(seqidno：4)。图11e显示粘滑罗氏菌(rothiamucilaginosadsm20746)菌株的16s核糖体rna基因的核酸序列，部分序列ncbi参考序列：nr_044873.1。具体实施方式本发明部分地提供了细菌组合物及其它们的应用方法。所述细菌组合物可用于，但不限于，对有需要的对象改变肠道菌群，填充胃肠道，或诊断或治疗肠道生态失调，哮喘，过敏症或特异性反应。细菌组合物及其应用本发明所述的细菌组合物，可以包括一种或多种瘤胃菌科(ruminococcaceae)的细菌，或一种或多种毛螺菌科(lachnospiraceae)的细菌，或一种或多种韦荣球菌科(veillonellaceae)的细菌，或一种或多种微球菌科(micrococcaceae)的细菌。在一些实施方式中，本发明所述的细菌组合物可以包括的一种或多种粪杆菌属(faecalibacterium)的细菌，一种或多种毛螺菌属(lachnospira)的细菌，一种或多种韦荣球菌属(veillonella)的细菌，或一种或多种罗氏菌属(rothia)的细菌。在一些实施方式中，本发明所述的细菌组合物可以包括两种或多种粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)或罗氏菌属(rothia)的细菌。在一些实施方式中，本发明所述的细菌组合物可以包括三种或多种粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)或罗氏菌属(rothia)的细菌。在一些实施方式中，本发明所述的细菌组合物可以包括四种或多种粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)和罗氏菌属(rothia)的细菌。在一些实施方式中，本发明所述的细菌组合物可以包括下列属的细菌的组合：粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)或罗氏菌属(rothia)。粪杆菌属(faecalibacterium)和毛螺菌属(lachnospira)；粪杆菌属(faecalibacterium)和韦荣球菌属(veillonella)；粪杆菌属(faecalibacterium)和罗氏菌属(rothia)；毛螺菌属(lachnospira)和韦荣球菌属(veillonella)；毛螺菌属(lachnospira)和罗氏菌属(rothia)；韦荣球菌属(veillonella)和罗氏菌属(rothia)；粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)和韦荣球菌属(veillonella)；粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)和罗氏菌属(rothia)；粪杆菌属(faecalibacterium)，韦荣球菌属(veillonella)和罗氏菌属(rothia)；毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)和罗氏菌属(rothia)；粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)和罗氏菌属(rothia)。在一些实施方式中，粪杆菌属(faecalibacterium)的细菌可包括普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)(以前也称普拉梭杆菌(fusobacteriumprausnitzii)，厌氧粘膜杆菌(bacillusmucosusanaerobius)，或普氏拟杆菌(bacteroidespraussnitzii))或包含所述菌种的操作分类单位(otu)。在一些实施方式中，所述粪杆菌属(faecalibacterium)可包括粪杆菌属(faecalibacteriumsp.cag:1138)(又名faecalibacteriumsp.mgs:1138)，粪杆菌属(faecalibacteriumsp.cag:82)(也称faecalibacteriumsp.mgs:82)，粪杆菌属(faecalibacteriumsp.cag:74)(也称faecalibacteriumsp.mgs:74)，粪杆菌属(faecalibacteriumsp.djf_vr20)，粪杆菌属犬口类分类群147(faecalibacteriumsp.canineoraltaxon147)，或粪杆菌属(faecalibacteriumsp.mc_41)。在一些实施方式中，所述普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)可包括菌株faecalibacteriumprausnitziil2-6，faecalibacteriumcf.prausnitziikle1255，faecalibacteriumprausnitziisl3/3，faecalibacteriumprausnitziim21/2，或faecalibacteriumprausnitziia2-165。在一些实施方式中，所述普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)可以是保藏于美国典型培养物保藏中心(atcc)的编号为atcc27766或atcc27768的普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)。在一些实施方式中，所述普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitziiatcc27766)可包括genbank登录号为x85022.1(seqidno：1)的16srrna基因。在一些实施方式中，所述普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)可包括一个16srrna基因，所述16srrna基因与genbank登录号为x85022.1(seqidno：1)的16srrna基因具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同源性。在一些实施方式中，所述普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitziiatcc27768)可包括，genbank登录号为aj413954.1(seqidno：2)的16srrna基因。在一些实施方式中，所述普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)可包括一个16srrna基因，所述16srrna基因与genbank登录号为aj413954.1(seqidno：2)的16srrna基因具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同源性。在一些实施方式中，毛螺菌属(lachnospira)的细菌可包括多毛毛螺菌(lachnospiramultipara)(以前称为lachnospiramultiparis)或裂果胶毛螺菌(lachnospirapectinoschiza)，或包含所述菌种的操作分类单位(otu)。在一些实施方式中，所述多毛毛螺菌(lachnospiramultipara)可以是lachnospiramultiparad32，lachnospiramultiparalb2003，lachnospiramultiparamc2003，或lachnospiramultiparadsm-3073。在一些实施方式中，所述多毛毛螺菌(lachnospiramultipara)可以是保藏于atcc的编号为atcc19207或dsm-3073的lachnospiramultipara。在一些实施方式中，所述lachnospiramultiparadsm-3073可包括模式菌株dsm3073t的16srrna基因，其genbank登录号为fr733699.1(seqidno:3)。在一些实施方式中，所述多毛毛螺菌(lachnospiramultipara)可包括一个16srrna基因，所述16srrna基因与genbank登录号为fr733699.1(seqidno:3)的16srna具有至少95％，96％，97％，98％，99％的序列同源性。在一些实施方式中，所述裂果胶毛螺菌(lachnospirapectinoschiza)可以是lachnospirapectinoschiza菌株150-1。在一些实施方式中，所述裂果胶毛螺菌(lachnospirapectinoschiza)可以是保藏于atcc的编号为atcc49827的裂果胶毛螺菌(lachnospirapectinoschiza)。在一些实施方式中，所述韦荣球菌属(veillonella)的细菌可包括小韦荣球菌(veillonellaparvula)，非典型韦荣球菌(veillonellaatypica)，极小韦荣球菌(veillonellaparvulaparvula)，殊异韦荣球菌(veillonelladispar)，罗戈沙韦荣球菌(veillonellarogosae),veillonellaseminalis，veillonellasp.口腔分类群780菌株f0422(veillonellasp.oraltaxon780str.f0422)，当别町韦荣菌(veillonellatobetsuensis),蒙皮立韦荣菌(veillonellamontpellierensis)，veillonellamagna，veillonellasp.口腔分类群158菌株f0412(veillonellasp.oraltaxon158str.f0412)，大鼠韦荣菌(veillonellaratti)，仓鼠韦荣球菌(veillonellacriceti)，或包含所述菌种的操作分类单位(otu)。在一些实施方式中，所述小韦荣球菌(veillonellaparvula)可以是veillonellaparvulaatcc10790/dsm2008/jcm12972/te3，veillonellaparvulaacs-068-v-sch12,veillonellaparvulaatcc17745，或veillonellaparvulahsivp1。在一些实施方式中，所述小韦荣球菌(veillonellaparvula)可以是保藏于atcc的编号为atcc10790的veillonellaparvula。在一些实施方式中，所述小韦荣球菌(veillonellaparvula)可包括genbank登录号为nr_043332.1(seqidno：4)的16srrna基因。在一些实施方式中，所述小韦荣球菌(veillonellaparvula)可包括一个16srrna基因，所述16srrna基因与genbank登录号为nr_043332.1(seqidno:4)的16srna基因具有至少95％，96％，97％，98％，99％的序列同源性。在一些实施方式中，所述非典型韦荣球菌(veillonellaatypica)可以是veillonellaatypicakon/atcc17744/dsm20739/nctc11830，veillonellaatypicad15，veillonellaatypicaacs-049-v-sch6或veillonellaatypicaacs-134-v-col7a。在一些实施方式中，所述殊异韦荣球菌(veillonelladispar)可以是veillonelladisparatcc17748，或veillonelladispardora_11。在一些实施方式中，所述罗戈沙韦荣球菌(veillonellarogosae)可以是veillonellarogosaeccug54233/dsm18960/jcm15642/veillonellasp.nvg05cf。在一些实施方式中，所述veillonellaseminalis可以是veillonellaseminalisacs-216-v-col6b(也称为大鼠韦荣菌(veillonellarattiacs-216-v-col6b))，或veillonellaseminaliscip107810/mg28162/veillonellasp.adv4313.2/veillonellasp.va109。在一些实施方式中，所述当别町韦荣菌(veillonellatobetsuensis)可以是veillonellatobetsuensisatccbaa-2400/jcm17976/veillonellasp.a16/veillonellasp.b4/veillonellasp.im-2011/veillonellasp.jcm17976/veillonellasp.y6/菌株b16。在一些实施方式中，所述蒙皮立韦荣菌(veillonellamontpellierensis)可以是veillonellamontpellierensisccug48299/cip107992/dsm17217/veillonellasp.2001-112662/veillonellasp.adv2216.03/veillonellasp.adv281.99/veillonellasp.adv3198.03/菌株adv281.99，或veillonellamontpellierensisdnf00314。在一些实施方式中，所述veillonellamagna可以是veillonellamagnadsm19857(也称为veillonellamagnalac18)。在一些实施方式中，所述大鼠韦荣菌(veillonellaratti)可以是veillonellarattiatcc17746/dsm20736/jcm6512/nctc12019。在一些实施方式中，所述仓鼠韦荣球菌(veillonellacriceti)可以是veillonellacricetiatcc17747/dsm20734/jcm6511/nctc12020。在一些实施方式中，所述罗氏菌属(rothia)的细菌可包括粘滑罗氏菌(rothiamucilaginosa)(以前称之为粘滑口腔球菌(stomatococcusmucilaginosus)或粘滑微球菌(micrococcusmucilaginous))，龋齿罗氏菌(rothiadentocariosa)，空间罗氏菌(rothiaaeria)，鼠鼻罗氏菌(rothianasimurium)，rothiamarina，土壤罗氏菌(rothiaterrae)，内生罗氏菌(rothiaendophytica)，污泥罗氏菌(rothiaamarae)，rothiaarfidiae，rothiasp.ccug25688，rothiasp.chdcb201，rothiasp.oralclonebp1-65，或包含所述菌种的操作分类单位(otu)。在一些实施方式中，所述粘滑罗氏菌(rothiamucilaginosa)可以是rothiamucilaginosa(菌株dy-18),rothiamucilaginosaatcc25296/ccm2417/ccug20962/cip71.14，rothiamucilaginosam508，rothiamucilaginosacc87lb，rothiamucilaginosam1710。在一些实施方式中，所述粘滑罗氏菌(rothiamucilaginosa)可以是保藏于atcc的编号为atcc49040或atcc25296的粘滑罗氏菌(rothiamucilaginosa)。在一些实施方式中，所述rothiamucilaginosaatcc49040可包括模式菌株dsm20746的16srrna基因，所述16srrna基因genbank登录号为nr_044873.1(seqidno:5)。在一些实施方式中，所述rothiamucilaginosaatcc49040可包括一个16srrna基因，所述16srrna基因与genbank登录号为nr_044873.1(seqidno:5)的16srrna基因具有至少95％，96％，97％，98％，99％的序列同源性。在一些实施方式中，所述龋齿罗氏菌(rothiadentocariosa)可以是rothiadentocariosa(菌株atcc17931/cdcx599/xdia)，rothiadentocariosam567。在一些实施方式中，所述空间罗氏菌(rothiaaeria)可以是rothiaaeriaf0474，rothiaaeriaf0184(也称为rothiasp.口腔分类群188菌株f0184(rothiasp.oraltaxon188str.f0184))，rothiaaeriadsm14556/gtc867/jcm11412/rothiaaerius/菌株a1-17b。在一些实施方式中，所述鼠鼻罗氏菌(rothianasimurium)可以是rothianasimuriumccug35957/cip106912/jcm10909/rothiasp.m7sw7a/rothia-样sp.ccug35957。在一些实施方式中，所述rothiamarina可以是rothiamarinadsm21080/kctc19432/rothiasp.g7/rothiasp.jsm078151/菌株jsm078151。在一些实施方式中，所述土壤罗氏菌(rothiaterrae)可以是rothiaterraebcrc17588/jcm15158/lmg23708/rothiasp.l-143/菌株l-143。在一些实施方式中，所述内生罗氏菌(rothiaendophytica)可以是rothiaendophyticadsm26247/jcm18541/rothiasp.yim67072/yim67072。在一些实施方式中，所述污泥罗氏菌(rothiaamarae)可以是rothiaamaraeas4.1721/ccug47294/jcm11375/kocuriasp.j-18/菌株j18。在一些实施方式中，本发明所述的细菌组合物可包括以下普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)，多毛毛螺菌(lachnospiramultipara)，小韦荣球菌(veillonellaparvula)，或粘滑罗氏菌(rothiamucilaginosa)的组合：普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)和多毛毛螺菌(lachnospiramultipara)；普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)和小韦荣球菌(veillonellaparvula)；普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)和粘滑罗氏菌(rothiamucilaginosa)；多毛毛螺菌(lachnospiramultipara)和小韦荣球菌(veillonellaparvula)；多毛毛螺菌(lachnospiramultipara)和粘滑罗氏菌(rothiamucilaginosa)；小韦荣球菌(veillonellaparvula)和粘滑罗氏菌(rothiamucilaginosa)；普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)，多毛毛螺菌(lachnospiramultipara)和小韦荣球菌(veillonellaparvula)；普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)，毛螺菌属(lachnospira)和粘滑罗氏菌(rothiamucilaginosa)；普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)，小韦荣球菌(veillonellaparvula)和粘滑罗氏菌(rothiamucilaginosa)；多毛毛螺菌(lachnospiramultipara)，小韦荣球菌(veillonellaparvula)和粘滑罗氏菌(rothiamucilaginosa)；普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)，多毛毛螺菌(lachnospiramultipara)，小韦荣球菌(veillonellaparvula)和粘滑罗氏菌(rothiamucilaginosa)。所谓“操作分类单位”或“otu”是指，采用本发明所述的或本领域已知的技术，对处于相同或不同otu的微生物进行分类。otu是指系统树的终端叶，通过一个核酸序列来定义，例如，在物种水平上，整个基因组，或特定的基因序列，以及所有序列与这一核酸序列具有同源性。在一些实施方式中，所述特定的基因序列可以是细菌的16srrna序列，或16srrna序列的一部分。在其它实施方式中，可以对两种生物的整个基因组进行测序和比较。在另一实施方式中，选择的区域，例如多位点序列标签(mlst)，特定的基因，或基因组可以进行基因比较。在16srrna的实施方式中，整个16srrna或16srrna基因的部分可变区具有>97％的平均核苷酸同源性的otu，被认为是相同的otu31-32。在涉及完整基因组，mlsts，特定的基因或基因组的实施方式中，具有>95％的平均核苷酸同源性的otu被认为是相同的otu32-33。在某些情况下，otu是由生物体之间的序列比较来定义的。一般而言，小于95％序列同源性的序列不被认为是形成同一otu的一部分。otu还可以通过核苷酸标记的任意组合或基因(特别是高度保守的基因(例如“管家”基因))，或它们的组合来进行描述。这种描述采用了例如，wgs数据或全基因组序列。“16s测序”或“16s-rrna基因”或“16s”是指通过表征组成16s核糖体rna基因的核苷酸序列而推导得出的序列。细菌的16srdna的长度约为1500个核苷酸，用于系统发育的方法中重建一种细菌与另一种细菌的进化关系和序列同源性。16s序列用于系统发育的重建，因为它们一般是高度保守但含有特定的超变区，所述超变区包含足够的核苷酸多样性以区分大多数细菌和真菌的属和种。在一些实施方式中，otu可以使用crunchclust29来确定，并根据97％的同源性使用greengenes数据库30进行分类。在一些实施方式中，本发明所述的细菌组合物可包括含有与一个或多个seqidnos.1-5序列大体上相同的16srrna基因序列的细菌。所谓“大体上相同”是指，本发明所述的核酸序列仅有一个或多个保守取代，或一个或多个非保守的取代，缺失，或不破坏核酸分子生物功能的插入区别于参照序列。这样的序列可以是，在采用如fasta的方法与比较的序列在核苷酸水平上是最佳对齐时，具有至少70％，75％，80％，85％，90％或超过95％，或更一般地具有至少95％，96％，97％，98％，99％，或100％中的任意整数的同源性。对于核酸分子，比较的序列的长度可以是至少5，10，15，20，或25个核苷酸，或至少30，40或50个核苷酸。在可选的实施方式中，比较的序列的长度可以是至少60，70，80，或90个核苷酸，或超过100，200或500个核苷酸。序列同源性可以使用公众可获得的序列分析软件(例如，遗传学计算机组的序列分析软件包，威斯康星大学生物技术中心，大学路1710，麦迪逊，威斯康星州53705；或可从国家医学图书馆获得的blast软件；或按本发明所述的方法)容易地进行测定。这种软件相似的序列通过对各种替换，缺失，替换，以及其它的修饰方式分配同源性程度来匹配相似序列。可选择地，或附加地，如果两种核酸序列在高严格条件下杂交，它们可以是“大体上相同的”。在一些实施方式中，高严格条件是，例如，该条件下允许的杂交与以下条件下进行的杂交具有可比性：采用长度为至少500个核苷酸的dna探针，在含有0.5mnahpo4，ph为7.2，7％的sds，1mmedta和1％bsa(v级)的缓冲液中，在65℃条件下进行的杂交，或在含有48％甲酰胺，4.8×ssc，0.2mtris-cl，ph7.6，1×denhardt溶液，10％葡聚糖硫酸酯和0.1％sds的缓冲液中，在42℃条件下进行的杂交(这些是高严格northern或southern杂交的典型条件)。杂交可在约20至30min，或约2至6h，或约10至15h，或超过24h或更长时间来进行。分子生物学家常规进行的大量技术的成功也依赖高严格条件的杂交，如高严格pcr，dna测序，单链构象多态性分析，和原位杂交。与northern和southern杂交相比，这些技术通常采用较短的探针(例如，通常用于pcr或测序的约16个或更长的核苷酸，用于原位杂交的约40个或更长的核苷酸)。在这些技术中所使用的高严格性条件，是分子生物学领域技术人员公知的，例如在ausubel等34中可以找到这些高严格性条件的例子。在一些实施方式中，本发明所述的细菌组合物可包括本文所描述的存在于健康供体或个体中的经处理的粪便中的细菌。这种细菌组合物可以是“直接分离的”，而不是获得粪便后，采用培养或任何其他方法导致或意图导致菌群复制的结果。在一些实施方式中，本发明所述的细菌包括细菌孢子。在一些实施方式中，本发明所述的细菌组合物可包括人细菌菌株。在可替代的实施方式中，本发明所述的细菌组合物可包括一般不会在人体内发现的细菌菌株。在一些实施方式中，本发明所述的细菌组合物可包括能够定殖在接受所述细菌组合物的对象的肠道。在一些实施方式中，本发明所述的细菌组合物可包括活细菌。在一些实施方式中，本发明所述的细菌组合物可包括大体上纯的粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)和/或罗氏菌属(rothia)的细菌。“大体上纯的”或“分离的”是指粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)和/或罗氏菌属(rothia)的细菌从与之天然共存的组分中分离出来，如粪便或肠道中。典型地，当本发明所述的细菌组合物按重量计占样品总物质的至少50％，60％，70％，75％，80％，或85％，或超过90％，95％，或99％时，其大体上是纯的。本发明所述的大体上纯的细菌组合物，可以从如天然原料中提取获得，例如来自健康个体的粪便，或细菌培养物，例如，本发明所述的任何细菌的培养物，如普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)，多毛毛螺菌(lachnospiramultipara)，小韦荣球菌(veillonellaparvula)，和/或粘滑罗氏菌(rothiamucilaginosa)。本发明所述的细菌组合物可用于，但不限于，对有需要的对象改变肠道菌群，填充胃肠道，或诊断或治疗肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应。在一些实施方式中，治疗肠道生态失调可预防所述对象的哮喘，过敏症或特异性反应。所述术语哮喘是指常见的气道慢性炎症性疾病，其具有复发，反复出现的症状，可逆的气流阻塞以及支气管痉挛的特点。常见的症状包括喘息，咳嗽，胸闷，以及呼吸急促。所述术语生态失调是指体内或体表微生物失衡，多数情况是指消化道或肠道的环境。任何微生物群或微生物组的健康(如，理想的)状态的破坏都会被认为是生态失衡，即使这样的生态失衡不会导致可检测的健康状态的下降。生态失调可以是不健康的，它可能是仅在某些条件下不健康的，也可以是防止个体变得更健康。生态失调可以是由于，例如，菌群多样性的减少。它与如炎症性肠病，结肠炎，慢性疲劳综合症，肥胖，癌症和哮喘等疾病相关。所述术语特异性反应是指对过敏原(如环境过敏原)超敏反应的遗传易感性。特异性反应包括，但不限于，特异反应性皮炎(湿疹)，过敏性鼻炎(花粉热)，过敏性哮喘和与特异性反应相关的疾病，如食物过敏，过敏性结膜炎和嗜酸细胞性食管炎。所述术语过敏症是指对过敏原的异常免疫反应。所谓“填充胃肠道”是指建立个体的微生物群或微生物组的健康状态。在一些实施方式中，填充胃肠道包括增加或减少对象的胃肠道中特定细菌的水平。在一些实施方式中，填充胃肠道包括增加对象的胃肠道中的本发明所述的细菌水平。所谓“改变肠道菌群”是指对象的微生物群或微生物组的任何变化，或增加或减少。在一些实施方式中，改变肠道菌群包括增加或减少对象的特定细菌的水平，如胃肠道中细菌的水平。在一些实施方式中，改变肠道菌群包括增加对象的胃肠道中的本发明所述的细菌水平。所谓“增加”，“提高”，“减少”或“降低”是指对象的胃肠道中特定细菌水平的变化。增加或减少可包括与对照相比的10％至100％之间，或30％至60％之间，或超过100％的任意值的变化，例如，约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或更多的变化。在一些实施方式中，增加或减少可以是与对照相比的约1倍，2倍，5倍，10倍，100倍，或更多倍的变化。“微生物群”是指发生(持续地或瞬时地)在动物体内或动物体表的微生物群落，典型的是哺乳动物，如人，也包括真核生物，古细菌，细菌和病毒(包括细菌病毒，例如噬菌体。“微生物组”是指持续地和瞬时地生活在人体内或人体表的微生物群落的遗传物质，包括真核生物，古细菌，细菌和病毒(包括细菌病毒，例如噬菌体)，其中“遗传物质”包括基因组dna，rna，如核糖体rna，表观基因组，质粒，以及其它类型的遗传信息。所述术语“治疗”，“处理”或“疗法”包括预防性的，缓和性的，治疗性的，以及营养性的给予本发明所述的细菌组合物的方式。相应地，治疗包括改善，减轻，逆转，或完全消除对象的一种或多种症状，所述对象被诊断为或已知具有肠生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应，或被认为能从所述肠道菌群的改变中受益。在一些实施方式中，治疗包括减少肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应的一种或多种症状的10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或者更多。治疗还包括预防或延迟肠道生态失调，哮喘，过敏症或特异性反应的一种或多种症状的发作。本发明所述的对象可以是哺乳动物，例如人，非人灵长类动物(例如，猴，狒狒，或黑猩猩)，大鼠，小鼠，兔，豚鼠，沙鼠，仓鼠，牛，马，猪，绵羊，山羊，狗，猫，等等。在一些实施方式中，所述对象是患者。所述对象可以是婴幼儿，如不到一岁或不到三个月大的人婴儿。在一些实施方式中，所述对象可以是1天至350天之间任意大的人婴儿，如1天，10天，20天，30天，40天，50天，60天，70天，80天，90天，100天，110天，120天，130天，140天，150天，160天，170天，180天，190天，200天，210天，220天，230天，240天，250天，260天，270天，280天，290天，300天，310天，320天，330天，340天，或350天。在一些实施方式中，所述对象可以是胎儿。在一些实施方式中，所述对象可以是女性，如怀孕女性。在一些实施方式中，所述对象可以是家族史有哮喘，特异性反应，过敏症或肠道生态失调的怀孕的女性。在一些实施方式中，所述对象可能已经接受，正在接受，或即将接受抗生素治疗。所述对象可以是临床患者，临床试验志愿者，实验动物，等等。所述对象可以是被怀疑患有或具有患肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应的风险；可以是被诊断为肠道生态失调，哮喘，过敏症或特异性反应；或者是确认不患肠道生态失调，哮喘，过敏症或特异性反应的对照个体。对于肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应的诊断方法，以及这种诊断的临床界定是本领域普通技术人员已知的。在一些实施方式中，所述对象可以是被认为能从肠道菌群的改变中受益的个体。在一些实施方式中，所述对象可以是被认为能从填充胃肠道中受益的个体。医药和营养组分，剂量及给药本发明所述的细菌组合物，可以以本发明所述的适合给予对象的形式单独使用，或在载体的存在下与其他化合物或组合物组合使用。当对象是胎儿时，本发明所述的细菌组合物，可以给予其母亲(即，所述对象可以是怀孕女性)。在一些实施方式中，本发明所述的细菌组合物可以是治疗组合物，预防组合物，营养组合物或益生菌组合物。在一些实施方式中，细菌组合物可以是包含粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)和/或罗氏菌属(rothia)的细菌的治疗组合物，预防组合物，营养组合物或益生菌组合物。在一些实施方式中，细菌组合物可以是包含普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)，多毛毛螺菌(lachnospiramultipara)，小韦荣球菌(veillonellaparvula)和/或粘滑罗氏菌(rothiamucilaginosa)的治疗组合物，预防组合物，营养组合物或益生菌组合物。必要时，本发明所述的细菌组合物可与用于肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应的更传统的和已知的治疗方法相结合。在一些实施方式中，本发明所述的细菌组合物可以与一种或多种治疗哮喘的方法相结合，包括但不限于，短效支气管扩张剂，β2-激动剂，吸入性糖皮质激素，长效支气管扩张剂，抗白三烯，抗ige疗法，口服皮质类固醇或茶碱。在一些实施方式中，本发明所述的细菌组合物可与一种或多种以下药物相结合，包括非诺特罗，福莫特罗，异丙托铵，异丙肾上腺素，奥西那林，沙丁胺醇，沙丁胺醇，特布他林，布地奈德，氟替卡松，环索奈德，二丙酸倍氯米松，沙美特罗，孟鲁司特，扎鲁司特，奥马珠单抗，氢化波尼松，或强的松。在一些实施方式中，本发明所述的细菌组合物可以与一种或多种用于过敏症的治疗方法相结合，包括但不限于，抗组胺剂，减充血剂，类固醇，支气管扩张剂，肥大细胞稳定剂，或白三烯调节剂。在一些实施方式中，本发明所述的细菌组合物可以与以下药物中的一种或多种相结合，包括西替利嗪，环索奈德，酮替芬，左西替利嗪，氟替卡松，糠酸盐，肾上腺素，氯马斯汀，孟鲁司特，布地奈德，奥洛他定，马来酸罗托沙敏，莫米松，氟尼缩松，色甘酸钠，去炎松，羟甲唑啉，依匹斯汀，地塞米松，克敏能，氯雷他定，苯海拉明，倍氯米松，氮卓斯汀，氯替泼诺，非索非那定，或neodrocromil的钠盐。在一些实施方式中，可以在对象用抗生素治疗之前，或期间，或之后，给予本发明所述的细菌组合物。在一些实施方式中，本发明所述的细菌组合物可以与一种或多种抗生素相结合，包括但不限于，链霉素，氨苄西林，阿莫西林，亚胺培南，哌拉西林/他唑巴坦，环丙沙星，四环素，氯霉素或替卡西林。本发明所述的术语益生菌，是指当服用的时候，能够对健康有益的微生物的一种或多种或其混合物。所述细菌组合物可长期或间歇地使用。“长期”给药是指药剂的给予以连续的方式而非急性的模式，以便在很长一段时间能够保持初始的治疗效果(活性)。“间歇”给药是指治疗并非是连续不间断进行的，而是在性质上是周期进行的。可以采用常规的药物或营养方法，以提供合适的制剂或组分，来对已经患有或将要发展为肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应的对象，给予本发明所述的细菌组合物。任何合适的给药途径都可使用，例如，皮肤，鼻腔，吸入型气雾剂，外用，灌胃，直肠或口服给药。所述细菌组合物可以被制备成各种形式。这些形式包括，例如，液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(如可注射和可输注的溶液)，分散体或悬浮液，片剂，丸剂，粉剂，脂质体和栓剂。优选的形式部分取决于给药的方式和用途。制剂可以是液体溶液或悬浮液的形式；对于口服用药，制剂可以是片剂或胶囊的形式；用于儿科的口服给药，制剂可以是液体或悬浮液的形式；或对于鼻腔制剂，可以是粉末，滴鼻剂或气雾剂的形式。所述制剂可以是缓释制剂。在一些实施方式中，本发明所述的细菌可以被配制为儿科制剂，例如液体悬浮液。本发明所述的细菌组合物可以被配制为营养组合物，如医疗食品，营养或膳食补充剂，食品或饮料，以及包括营养学上可接受的载体。如本发明所使用的，“营养学上可接受的载体”是指包括任何以及所有的溶剂，分散介质，包衣，抗菌剂和抗真菌剂，等渗和吸收延迟剂，及其生理学上相容的类似物。该组合物可包括营养学上可接受的盐，例如，酸加成盐或碱加成盐。在一些实施方式中，营养学上可接受的载体适用于儿科。本发明所述的细菌组合物，可以被配制为药物组合物，并且包括药学上可接受的载体。如本发明所使用的，“药学上可接受的载体”是指包括任何以及所有的溶剂，分散介质，包衣，抗菌剂和抗真菌剂，等渗和吸收延迟剂，及其生理学上相容的类似物。该组合物可包括药学上可接受的盐，例如，酸加成盐或碱加成盐。在一些实施方式中，所述药学上可接受的载体适用于儿科。本领域熟知的用于制备制剂的方法例如在真纳罗35中有介绍。用于肠胃外给药的制剂可以是，例如含有赋形剂，无菌水，或生理盐水，聚亚烷基二醇如聚乙二醇、植物来源的油脂、或氢化萘。可以采用生物相容的，可生物降解的丙交酯聚合物，丙交酯/乙交酯共聚物，或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物来控制化合物的释放。其他潜在有用的肠胃外递送系统包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物颗粒，渗透泵，可植入的输注系统，以及脂质体。用于吸入的制剂可以含有赋形剂，例如乳糖，或可以是水溶液，例如聚氧乙烯-9-十二烷基醚，甘胆酸盐和脱氧胆酸盐，或可以是滴鼻剂或凝胶形式给药的油性溶液。对于治疗组合物或预防组合物，根据病情需要，所述化合物以能足够阻止或减缓肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异反应性的量给予对象。本发明所述细菌组合物的“有效量”包括能足够在对象肠道定殖一段合适时间而确定的量，例如，通过检测来自对象在给药后特定时间的样品，如粪便样品中的一种或多种粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)和/或罗氏菌属(rothia)的细菌的存在。在一些实施方式中，有效量包括治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是指在必要的一段时间和剂量条件下，能实现期望治疗结果的有效剂量，例如对肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应的治疗，预防或改善。由于因素的不同，例如对象的疾病状态、年龄、性别和体重，以及所述细菌组合物在个体中引发所需应答的能力，细菌组合物的治疗有效量可以不同。给药方案可以调整以提供最佳的治疗效果。治疗有效量也是细菌组合物的治疗的有益效果超过其任何的毒性或有害作用。“预防有效量”是指在必要的一段时间和剂量条件下，能实现期望预防效果的有效剂量，例如对肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应的治疗，预防或改善。典型地，预防剂量是在对象发病之前或在发病早期使用，因此，预防有效量可以少于治疗有效量。“益生菌”的量是指在必要的一段时间和剂量条件下，能实现期望效果的有效剂量，例如在进行抗生素治疗后，填充对象的胃肠道直至正常水平。典型地，给予的益生菌的量会大大过量，可显著高于预防有效量或治疗有效量。本发明所述的细菌组合物的治疗有效量或预防有效量，或益生菌的量，每单位剂量可以包括但不限于至少约106，107，108，109，1010，1011，1012，1013或1014个菌落形成单位细菌(cfus)。在一些实施方式中，以繁殖体或孢子形式给药的活细菌的剂量，每剂或每份组合物可以是约1ug至约1000mg，例如约0.5mg至约5mg，约1mg至约1000mg，约2mg至约200mg，约2mg至约100mg，约2mg至约50mg，约4mg到约25mg，约5mg至约20mg，约10mg到约15mg，约50mg至约200mg，约200mg至约1000mg，或约1，2，3，4，5或多于5g；或每剂或每份组合物可以是0.001mg至1mg，0.5mg至5mg，1mg至1000mg，2mg至200mg，或2mg至100mg，或2mg至50mg，或4mg至25mg，或5mg至20mg，或10mg至15mg，或50mg至200mg，或200mg至1000mg，或1，2，3，4，5或多于5g。应当注意的是，剂量值可以随着病症严重程度得到缓解而变化。对于任何特定的对象，特定的给药方案可随着时间根据个体需要以及给予组合物或监督给予组合物的人员的专业判断进行调整。本发明所阐述的剂量范围仅是示例性的，并不限制可能由执业医师选择的剂量范围。组合物中活性化合物的量可以根据多种因素而变化，例如个体的疾病状态，年龄，性别和体重。因此，在一些实施方式中，合适的剂量包括儿科剂量或适合给予怀孕女性的剂量。在一些实施方式中，合适的剂量包括益生菌的量，如儿科益生菌的量。可调整给药方案以提供最佳的期望的响应。例如，可采用单次推注的方式给药，可在一段时间分开几次给药，或根据情况的紧急程度按比例减少或增加所述剂量。将肠胃外组合物配制成易于给药和剂量一致性的剂量单位的形式，这可能是有利的。所述细菌组合物可每日或更频繁地施用，如每日两次或更多次。所述细菌组合物可以在食用食品或饮料之前，期间或之后施用。检测方法本发明还提供了确定对象发展为肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应的可能性的方法，所述方法包括确定对象的一种或多种粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)或罗氏菌属(rothia)的细菌的水平，并将所确定的水平与参考值或健康个体(诊断为不患有肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应的个体)的水平相比较；其中，一种或多种粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)韦荣球菌属(veillonella)或罗氏菌属(rothia)的细菌水平的下降或减少表明发展为肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应的可能性增加。一般来说，在对象和参考值或健康个体之间统计意义上的显著差异，表明所述对象有可能发展肠道生态失调，哮喘，过敏症或特异性反应。在一些实施方式中，所述对象和参考值或健康个体之间在对数刻度上1或2的差值，可指示所述对象发展为肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应的可能性。在一些实施方式中，可测定来自对象的样品中的两种或多种粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)或罗氏菌属(rothia)的细菌水平。在一些实施方式中，可测定来自对象的样品中的三种或多种粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)或罗氏菌属(rothia)的细菌水平。在一些实施方式中，可测定来自对象的样品中的粪杆菌属(faecalibacterium，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)和罗氏菌属(rothia)的细菌水平。在一些实施方式中，确定对象发展为肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应的可能性，包括确定一种或多种代谢物的水平，如粪便乙酸，尿胆原，或胆汁酸(如游离胆汁酸)；其中，粪便中乙酸水平的降低或减少，或尿胆原或胆汁酸(如游离胆汁酸)的增加表明该对象很可能发展为肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应。所谓“确定”或“检测”是指包括对物质的存在与否进行确定，或对物质进行定量，例如本发明所述的一种或多种细菌，或代谢物。因此，该术语是指采用本发明所述的或本领域已知的材料，组合物和方法用于定性和定量测定。增加或减少可包括与对照相比的10％至100％之间，或30％至60％之间，或超过100％之间的任意值的变化，例如，约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或更大的变化。在一些实施方式中，增加或减少可以是与对照相比的约1倍，2倍，5倍，10倍，100倍，或更多倍的变化。可采用本发明所述的细菌组合物对已确定可能发展为肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应的对象进行治疗。在一些实施方式中，可以通过确定来自所述对象的样品中的一种或多种粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)或罗氏菌属(rothia)的细菌，或代谢物的水平，并与该对象之前确定的水平进行比较，来监测治疗的效果。“样品”可以是来自对象的任何器官，组织，细胞或细胞抽提物，如分离自患有，疑似患有或易患有肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应的哺乳动物的样品。例如，样品可以包括，但不限于，从患者(人或动物)、试验对象或实验动物获得的血液、尿、粪便、唾液或任何其他样品，或其任何提取物。“对照”包括用于确定基线表达或活性而获得的样品。因此，对照样品可以从健康个体中获得，如诊断为不患有肠道生态失调，哮喘，过敏症，或特异性反应的个体。对照还包括以前建立的标准或参考值。因此，任何测定或分析可以与已建立的标准进行比较，而没有必要每次都获得用于比较的对照样品。可以采用本领域已知的方法，诸如定量pcr，来检测所述样品中粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)或罗氏菌属(rothia)的基因，基因组，多肽，核酸分子(如粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)或罗氏菌属(rothia)的16srrna分子)的存在或其水平，以对样品进行分析。可以测定所述样品中代谢物如粪便乙酸，尿胆原，或胆汁酸(如游离胆汁酸)的存在或水平。通过以下实施例来对本发明作进一步说明。具体实施方式材料和方法方法研究设计，皮肤点刺试验和样品选择：儿童研究是一个多中心的纵向的，前瞻性的，普通群体出生队列研究，该研究在加拿大的4个站点(温哥华，埃德蒙顿，马尼托巴，多伦多)共招募了3624名怀孕女性，并从怀孕一直跟随婴幼儿到5周岁。儿童研究的详细特点在之前被描述过1。简要地说，在招募过程中，在妊娠36周，第3、6、12、18、24、30个月，以及在3，4和5周岁进行问卷调查。通过这种方式，获得与环境暴露，社会心理压力，营养以及总体健康状况有关的数据。此外，儿童哮喘和过敏性疾病的国际研究(isaac)2通过父母完成了1，3和5周岁的有效问卷调查。在1，3，和5周岁时，对每个孩子进行检查，以获得特异反应性皮炎，鼻炎或哮喘的证据。在1，3和5周岁时，训练有素的工作人员对皮肤进行标准化吸入性过敏原和常见食物过敏原的测试。5周岁的数据不包括在这项研究中，因为在提交日还未获得整个队列该数据。不列颠哥伦比亚大学/不列颠哥伦比亚研究伦理委员会儿童和妇女健康中心认可该项对人体样品的研究草案，每个参与的家长都签署了知情同意书。纳入/排除标准:皮肤点刺试验结果：在1岁龄时，对参与该项儿童研究的儿童测定10种过敏原(链孢菌(alternariatenuis)，猫毛，狗上皮细胞，屋尘螨(dermatophagoidespteronyssinus)，粉尘螨(dermatophagoidesfarinae)，德国小蠊，花生，大豆，鸡蛋白和牛奶)。如果儿童的10项过敏原测试中，产生任意一个≥2mm的风团，则把他/她归为“特应性的”。组胺被用作阳性对照，甘油作为阴性对照。对组胺测试为阴性的对象不包括在这个队列中，除非他们在上面所列出的10种过敏原中测试出一个风团≥2mm。如果对象对甘油测试为阴性，则从对任何阳性过敏原反应的风团大小中减去其对甘油的风团大小。喘息问卷调查：如果儿童在1岁期间有因感冒或不因感冒的喘息(通过家长在3，6和12个月的问卷调查的回答进行记录)，则该儿童被列入喘息组。如果儿童研究的临床医生对儿童1岁龄的临床评估记录为喘息，则该儿童也被列入喘息组。生物样品：这个队列需要每名儿童在3月龄和1岁龄的粪便样品。对于对照组，儿童研究将收集到额外样品(例如血液样品)的对象从缺失这些样品的任何一种的对象中挑选出来。在出生符合合格标准的3542名儿童中，1427名儿童在选择时完成了儿童研究的1岁龄的临床评估。163名对象由于不完全的皮肤点刺试验数据，或对甘油的阳性响应，或对组胺以及所有其他过敏原的阴性响应，而被排除在外。将剩余的1264名对象分为四个临床表型，特异性反应+喘息组(aw)(n＝35)，仅特异性反应组(n＝150)，仅喘息组(n＝216)以及对照组(n＝863)，并评估3月龄和1岁龄的粪便样品的有效性[3月龄和1岁龄的粪便样品有效的数量分别为aw组(n＝25)，仅特异性反应组(n＝112)，仅喘息组(n＝179)，对照组(n＝106)]。如果在16sdna的制备和测序后，序列结果是不充分的(即每个粪便样品序列读数不足)，则该对象将被从该研究中排除[最后的数目n分别为，aw组(n＝22)，仅特异性反应组(n＝87)中，仅喘息组(n＝136)，和对照组(n＝74)]。用于qpcr，scfa，尿液代谢组学，和picrust分析的样品的子集包含所有可用的aw组的样品以及20个或更少的随机选择的对照样品。所选的样品数量取决于粪便或尿液样品的有效性，这在此项对人婴幼儿的研究中非常有限。哮喘预测指数(api)：根据哮喘预测指数3也对我们的样品队列中的对象(n＝319)进行分类。一个阳性的严格api由以下条件进行定义：在2至3周岁期间经常喘息，伴有2项主要标准中的1项，或3项次要标准中的2项。此外，如果儿童在3周岁的临床评估中被诊断为哮喘，则无论他们是否满足api标准，他们也被包含在阳性api组中。反复喘息：反复喘息定义为在2至3周岁期间的喘息发作次数≥3。在24个月、30个月和3周岁的问卷调查被用来量化2至3周岁期间喘息发作的次数。主要标准：哮喘的家族史(来自父母任何一方)，或在2至3周岁期间，由m.d.确诊为儿童期特异反应性皮炎。次要标准：≥4％嗜酸粒细胞增多，2周岁后非因感冒而引起的任何喘息的发作，以及在3周岁时被m.d.诊断为过敏性鼻炎。16s微生物群落分析从～50mg粪便或从总拭子分离的～50mg粪便涂覆的拭子中提取dna。在使用qiagendna粪便mini试剂盒提取dna前，采用mo-biodrybeadtubes(mobiolaboratories,carlsbad,ca)和fastprep均质器(fastprepinstrument,mpbiochemicals,solon,oh)对样品进行机械性的细胞裂解。如以前所描述的4，使用16s基因的v3区侧翼序列的条形码引物对(barcodedprimerpairsflankingthev3regionofthe16sgene)(表7)，对所有样品通过聚合酶链式反应(pcr)扩增为一式三份。表7:16sv3区的扩增引物和条形码每50μlpcr反应体系包含22μl水，25μltoptaqmastermix，0.5μl正向条形码引物，和0.5μl反向条形码引物，以及2μl模板dna。该pcr方法包括在95℃初始的dna变性步骤(5min)，95℃dna变性25个循环(1min)，50℃退火步骤(1min)，72℃延伸步骤(1min)，以及72℃的最终延伸步骤(7min)。无模板dna的体系作为对照，以确保没有污染发生。扩增子在2％琼脂糖凝胶上跑胶，以确保有足够的扩增。采用illustragxpcrdnapurificationkit对扩增子在～160kb的显示条带进行纯化。纯化的样品以1:50进行稀释，采用picogreen(invitrogen)在tecanm200上(激发波长480nm，发射波长520nm)进行定量测定。illumina测序：合并的pcr扩增子稀释至20ng/μl，采用hi-seq2000bidirectionalilluminasequencingandclusterkitv4(macrogeninc.,seoul,korea)在v3超可变区进行测序。使用truseqdnasampleprepv2kit(illumina)，100ngdna样品和qc库，通过bioanalyzerdna1000chip(agilent)来完成文库的制备。生物信息学将样品预处理，去噪，使用mothur5按大小进行质量过滤。使用crunchclust6将代表性的序列聚集到操作分类单位(otu)，并根据97％的同源性依据greengenes数据库7进行分类。任何在所有样品中存在少于5次的otu，被从该分析中去除。定量聚合酶链式反应采用组特异性16srrna基因引物，对特定属的肠细菌的所述16srdnav3扩增子的丰度进行测定，所述属包括毛螺菌属(lachnospira)，韦荣球菌属(veillonella)，罗氏菌属(rothia)，粪杆菌属(faecalibacterium)和双歧杆菌属(bifidobacterium)(表8)。表8：选定属的细菌的定量pcr引物序列通过定量pcr(qpcr)对所有aw组的样品和一个随机选择的相等数量的对照样品进行分析。所有反应均在7500fastreal-timesystem(appliedbiosystems,fostercity,ca)或viia7real-timepcrsystem(lifetechnologiesinc.,burlington,on)中进行。每10μl反应体系包含5μliqsybrgreensupermix(bio-rad,5μl)，0.1μl正向引物，0.1μl反向引物，0.8μl无核酸酶的水，以及4μl的v3扩增子。所述qpcr方法包括一个在95℃的初始步骤(15min)，在94℃15s，60℃30s，72℃30s的40个循环，以及一个在95℃15s，60℃1min，95℃15s，和60℃15s的最终循环。每个样品的每个引物对，至少运行两个稀释浓度，所有稀释浓度均一式两份运行。根据δct方法，采用总16srdna作为参考基因，对样品进行标准化。picrust：我们使用picrust8从我们的16srrnaotu数据中生成一个推定的函数轮廓(profileofputativefunctions)(通过宏基因组预测)。通过qpcr分析的来自相同样品的预测的宏基因组，通过函数在kegg(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes)orthologylevel3上进行分类。我们采用stamp9的welcht检验方，来检测aw和对照样品之间在函数分类丰度上的显著差异。我们还采用deseq210在默认设置下检测了差异丰富的宏基因组。采用benjamini和hochberg方法11对多重检验的统计p值进行校正(错误发现率阈值＝5％)。短链脂肪酸分析：粪便样品与25％的磷酸涡旋混合，离心，直至获得澄清的上清液。将上清液提交给阿尔伯塔大学农业食品和营养科学系进行gc分析。只有13个aw样品含有足够的材料用于分析，以及13个额外的随机选择的对照样品用于这一分析。如之前所述的方法12对样品进行分析与修订。简言之，将样品用4-甲基-戊酸混合以作为内标，并将0.2ml注入使用stabilwax-da30m×0.53mm×0.5um柱(restek,bellefonte,pa)的brukerscion456气相色谱仪。每次运行时，注入含有乙酸，丙酸，异丁酸，丁酸，异戊酸，戊酸和己酸的标准溶液和内标。在整个运行过程中，ptv注射器和fid检测器的温度维持在250℃。烘箱在80℃开始，然后以45℃/min的速度迅速升温至210℃，并保持5.11min。总运行时间为8.00min。氦的恒定流量为20.00ml/min。尿液代谢组学：将每个对象的250μl尿液提交到metabolon公司(durham,nc)进行代谢组学分析。选择用于qpcr分析的样品子集中，16-18个aw和对照组的尿液样品可用于代谢组学分析。按以前所述的方法13制备样品。简言之，在提取过程的第一步之前加入回收标准以用于质量控制。剧烈振荡2min(glenmillsgenogrinder2000)，离心，用甲醇沉淀去除蛋白。将得到的提取物分成五份：一份用于超高效液相色谱-串联质谱(uplc-ms/ms；正离子化)分析，一份用于uplc-ms/ms(负离子化)分析，一份用于uplc-ms/ms极性平台(负离子化)分析，一份用于通过气相色谱-质谱(gc-ms)分析，一份样品用于备份。以下对照样品和实验样品一起进行分析：来源于由metabolon公司进行广泛表征的人尿样品池的样品，以及一个加入到每个被分析的样品中的使得仪器进行监控的标准品混合物。实验样品和对照样品随机跨平台运行。质谱分析通过gc-ms或uplc-ms/ms对提取物进行分析。所述uplc-ms/ms平台采用watersuplcbehc18-2.1×100mm，1.7μm柱的watersacquityuplc，热的电喷雾离子(hesi-ii)源连接的thermoscientificq-exactive高分辨率/准确性的质谱仪，以及在35,000质量分辨率下运行的orbitrap质谱仪。将样品提取物干燥，然后在酸性或碱性lc-相容的溶剂中重构，其中每个固定浓度的样品包含八个或更多个注射标准，以确保注射和色谱的一致性。在酸性条件下重构的提取物，采用含0.1％甲酸的水和甲醇进行梯度洗脱；而在碱性条件下重构的提取物，也采用水/甲醇进行梯度洗脱，所述水/甲醇包含6.5mm碳酸氢铵。使用包含10mm甲酸铵的水和乙腈从hilic柱(watersuplcbehamide2.1x150mm,1.7μm)进行洗脱后，通过负离子模式对第三等分样品进行分析。采用动态排除法，所述ms分析在ms和数据相关的ms2之间交替进行，其扫描范围为80-1000m/z。用于gc-ms分析的样品，在干燥氮气下采用双三甲基-甲硅烷基三氟乙酰胺(bistrimethyl-silyltrifluoroacetamide)进行衍生前，先在真空条件下干燥至少18h。衍生化的样品采用氦气作为运载气体，采用5％联苯/95％二甲基聚硅氧烷结合的二氧化硅柱(20m×0.18mm内径；0.18μm膜厚度)，在17.5min内从60℃升温至340℃的温度条件下进行分离。所有样品在采用电子轰击离子化(ei)的以单位质量分辨力下运行的thermo-finnigantracedsqfast-scanningsingle-quadrupolems上进行分析。扫描范围为50-750m/z。化合物鉴定，定量和数据监管采用metabolon14开发的软件，对试验样品和化学标准参考库的离子特性自动进行比较，包括保留时间，分子量(m/z)，优选的加合物，内源性片段，相关联的ms谱以及通过目测进行的管理，以对代谢物进行鉴定，从而进行质量控制。基于与纯化的标准代谢库条目进行比对，对已知化学实体进行确定。可商购的纯化的标准化合物已被获取并登记到lims中，并分配到uplc-ms/ms和gc-ms两个平台，以用于测定它们可检测的特征。使用面积下的曲线对峰进行定量。通过对每个运行日的中值进行设定，以对每个样品中每种代谢物的原始面积数进行标准化，来校正每个运行日仪器日间调谐差异引起的变异；因此，每次运行时将中值设定为1.0。缺失值用标准化后所观察到的最小值进行估算。每个样品的所有值均进一步标准化为摩尔渗透压浓度(osmolality)。人微生物群的小鼠实验性过敏性哮喘模型：细菌接种物的制备和接种：收集3月龄哮喘儿童的冷冻粪便，用来对无菌小鼠进行口服接种。粪便浆料的制备方法包括，用无菌解剖刀刮冷冻的粪便材料，并将其与1ml用0.05％半胱氨酸-盐酸还原的pbs进行混合，以保护厌氧菌。这种类型的过继转移已被证明在将人的微生物群转移到小鼠中是有效的15。将样品涡旋，在3000g下离心以除去碎片。普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii(atcc27766))，小韦荣球菌(veillonellaparvula(atcc10790))，粘滑罗氏菌(rothiamucilaginosa(atcc49040))和多毛毛螺菌(lachnospiramultipara(dsm-3073))的固体培养物在37℃厌氧条件下，生长在fastidiousanaerobe(fa)琼脂上。将每种培养物的一个菌落加入到2ml液体fa培养基中，培养24h。粪便浆料和flvr培养物的细胞浓度通过在600nm处的浊度分析进行计算，并通过经还原的pbs将od值标准化为0.3。从taconic公司(hudson,ny)购买6周龄四雌四雄无菌小鼠(swisswebster)。小鼠一旦送达，马上随机选择两只雌性和两只雄性小鼠，并口服灌胃50μl粪便浆料(aw)，剩余小鼠注射40μl相同粪便浆料和10μlflvr培养物。在送达后的第3、7和14天重复用微生物口服灌胃处理。在第二次接种后，对小鼠进行配对交配。为了进一步增加f1代小鼠对实验接种物的微生物种殖，在生产后的第3和7天，对小鼠母亲的腹部和乳头区域用相应的细菌制品进行擦拭。实验性过敏性哮喘模型：在以前所描述的方法16基础上稍作修改，对每个育种对随后的两窝幼崽的所有f1代小鼠，在7-8周龄时进行诱导，以得到实验性过敏性哮喘小鼠。尽管这种模型并不能完全概括人过敏性哮喘的表型，但它是评估这类肺部炎症性疾病的很多方面的有用模型。未采用统计学方法来评估动物实验的样品量。在两个组合实验中，共使用了8只对照，18只aw和28只aw+flvr小鼠。在第0天和第7天，用10μgv级ova和1.3mg氢氧化铝(二者均购自sigma)对小鼠进行腹腔致敏。在第21，22，23和24天用溶解在pbs中的50μg不含lps的ova，以及在第25，26天用100μgv级ova(sigma)对小鼠鼻内进行攻击。在第27天，用200mgkg-1氯胺酮和10mgkg-1甲苯噻嗪对小鼠进行麻醉，并通过心脏穿刺收集血液。处死小鼠后，用3×1mlpbs冲洗以执行bals。通过血球计数仪对细胞进行计数以对bal总数进行盲评。基于标准形态学准则，采用hemastain(fisherscientific)染色，使用细胞片子(thermoshandon,pittsburg,pa)对嗜酸性粒细胞，中性粒细胞，巨噬细胞和淋巴细胞进行定量。在这些实验中使用的所有方案都通过不列颠哥伦比亚大学的动物保护委员会的批准。血清ova特异性ig的测定：通过酶联免疫吸附试验(chondrex,redmond,wa)测定血清中ova特异性的ige，igg1和igg2a。组织学：收集肺并用10％福尔马林固定，然后包埋在石蜡中，纵向切成5μm的切片，然后苏木精和曙红染色。对每个切片的五个部分的炎症进行盲评，并对其在以下参数上进行1-5评分(1＝无疾病迹象，5＝疾病严重)：(1)支气管周围浸润，(2)血管周围浸润，(3)实质浸润和(4)上皮损伤；最高评分为25分。细胞因子肺组织匀浆以16,000g离心两次，上清液贮存在-80℃。采用cytometricbeadarray(cba)分析th1/th2/th17kit(catalog#560485bdbiosciences,ontario,canada)，对il-2，il-4，il-6，il-10，tnf，ifn-γ和il-17a水平进行测定。根据制造商的说明书，通过cbaflexset(catalog#558302,558348and558349,bdbiosciences,ontario,canada)测定il-5，il-9和il-13的水平。将细胞因子的浓度标准化为通过bradfordassay(sigma)分析的蛋白浓度。对il-9和il-13的分析没有产生超出所述分析方法灵敏度极限的结果。统计分析采用基于markovchainmontecarlo(mcmc)采样方法17-19构建的精确逻辑回归模型和比值比(ors)，根据特定的临床数据来评估与aw组相关的风险。根据以下e(ln(or))和e(ln(ci)公式，分别计算ors和置信区间校正后的上限和下限。ln(ci)等于表1中扩展数据的确切的置信区间的上限和下限。只有能获得所有数据的对象，才被纳入到该模型中(naw＝21,ncontrol＝74)。本发明使用phyloseq20以及r-studio软件(r-studio,boston,ma)中其他基于r的计算工具21-26对粪便微生物的多样性和细菌类群的相对丰度进行评估。使用metaboanalyst27,28完成了主成分分析(pca)，并通过permanova20进行了统计意义上的确认。使用phyloseq20计算shannon多样性指数，使用mann-whitney(graphpadprism软件，version5c,sandiego,ca)进行了统计意义上的确认。在phylsoeq20上的“mt”函数用于计算多推理校正(multi-inference-adjusted)的p值，来确定3月龄和1岁龄样品之间、以及四个表型之间(aw，仅特异性反应组，只有喘息组和对照组)的otu的差异丰度。对照组和aw组之间的差异通过对qpcr的mann-whitney检验来确定。对所有的scfa和尿代谢物采用shapiro-wilk进行正态性检验，并通过t检验或mann-whitneywilcoxon来确定对照组和aw组(glycocholenatesulfate和glycohyocholate)之间的差异。统计检验时没有排除人样品。对于使用人样品的分析，通过f-检验未发现各组的方差之间有显著差异。在小鼠实验中，通过anova对bal计数，bal细胞分类，组织学打分，肺细胞因子和血清免疫球蛋白的浓度进行分析，来确定aw，aw+flvr和对照组之间的差异。图表中所有的数据点代表生物学重复。对离群值进行检测，并使用graphpadprism软件中的rout方法(q＝1％)仅从小鼠实验数据中排除。统计意义上的显著性定义为p≤0.05。结果我们从这一队列中选择了319名儿童用于本发明所述的肠道微生物组分析，并基于皮肤过敏点刺测试(即特异性反应)和1岁龄的临床数据(即喘息)，将其分为下列四种临床不同的表型：特异性反应+喘息组(aw,n＝22)，仅特异性反应组(n＝87)，仅喘息组(n＝136)，以及对照组(n＝74)(图1)。此外，采用2和3周岁的临床数据，应用用于预测学龄期活动性哮喘存在的临床验证的预测指数7，即严格的哮喘预测指数(api)，来确证这些1岁龄表型的临床意义。在3周岁的阳性严格api与6至13周岁之间77％的活动性哮喘的几率是相关的8。儿童研究中，1岁龄aw组中为阳性严格api的对象比对照组[95％ci：3.2至57.4]高13.5倍(图1)。与仅特异性反应和只有喘息的表型相比，aw组在阳性api分类上也显著更多，说明这些孩子在学龄期具有更高发展为活动性哮喘的风险。与其他哮喘流行病学研究9一致，确切的逻辑回归分析确定了，与对照组相比，在1岁龄内对抗生素的暴露[or:5.6,p＝0.009]以及在一周岁时的特异反应性皮炎[or:6.4,p＝0.005]可以作为增加对象被列入aw组的风险因子(表1)。表1：研究人群的特征*对每个变量首先列出的组用于作为解释比值比的参考组。*未能获得置信区间有限的下限，因充分统计量所观察的值是可能的最大值。剖腹产10，独家配方喂养10和在婴幼儿期的抗生素暴露11也是与肠道微生物生态失衡有关的常见因素，这提示我们对其3月龄和1岁龄的粪便菌群进行评估，但这些因素在亚群中并非是显著的因素。与其他婴幼儿队列的微生物研究一致12，主成分分析(pca)确定了年龄是这一队列中微生物和新陈代谢变化的主要驱动力(图5、6，表2)。表2:3月龄和1岁龄样品中otu的差异丰度**otu以3月龄和1岁龄的丰度中值的最大差异排序。总的肠道菌落组成在临床表型之间并没有显著差异，如图所示为对3月龄和1岁龄样品进行的pca(图2a，图7a)。与3月龄和1岁龄的对照组相比，观察到aw组的多样性并未显著下降(图2b，图7b)。然而，根据临床表型的相对类群丰度的比较(图2c)，确定了一些较低丰度(lessabundant)的细菌类群(即microccocaceae和韦荣球菌科(veillonellaceae))在3月龄的粪便样品中的发生率的差异，这种差异在1岁龄的样品中并不存在(图7c)。这些差异在属的水平上更为明显(图8和图9)，其中aw组仅在3月龄的样品中表现出粪杆菌属(faecalibacterium)，毛螺菌属(lachnospira)，罗氏菌属(rothia)和韦荣球菌属(veillonella)的较低的丰度。在跨表型的前50个otu的统计分析中，在3月龄的样品中产生了8个差异丰度otu，而在1岁龄的样品中只产生了一个(表3；mt检验，原始p<0.05)。表3：3月龄和1岁龄的四种临床表型的差异丰度类群为了验证这些结果，通过定量pcr(qpcr)采用样品的一个子集(naw＝21,nctrl＝20)来确定韦荣球菌属(veillonella)，毛螺菌属(lachnospira)，罗氏菌属(rothia)，粪杆菌属(faecalibacterium)和双歧杆菌属(bifidobacterium)的细菌的丰度。此外，qpcr显示了在三月龄aw组的粪便样品中韦荣球菌属(veillonella)，毛螺菌属(lachnospira)，罗氏菌属(rothia)和粪杆菌属(faecalibacterium)的细菌显著降低的丰度(图2d，mann-whitneyp<0.001)。与16s测序结果一致，这些差异在1岁龄的粪便样品中更不明显(muchlessapparent)(韦荣球菌属(veillonella)和毛螺菌属(lachnospira)显示出差异并不那么显著(lesssignificantdifferences)(p<0.05)，而其它3个属并未有显著不同)，这表明在婴幼儿3月龄之前这些细菌类群较低的丰度与1岁龄的特异性反应和喘息相关。而且，与对照组相比，aw表型的儿童为阳性api的可能性高13.5倍(图1)，本发明的研究结果还表明，这些类群在生命早期的更低丰度(lowerabundances)与学龄期活动性哮喘的高风险相关。为了确定在婴幼儿早期的生态失调对哮喘高风险的重要性，采用picrust对粪便微生物的功能潜力进行预测，所述picrust是一种基于标记基因数据和参考细菌基因组对微生物菌落的功能宏基因组进行推断的算法。我们比较了用于qpcr测定的相同的样品子集经推断的粪便微生物遗传组成(图2e-f)。我们观察到许多与aw表型相关的基因。总共调查的6911个基因(定义为kegg同源序列；ko)中，2364个基因在3月龄的样品中显著不同，而只有125个在1岁龄的样品中显著不同(wald检验和fdr，p<0.05)。排在最前的30个差异基因(基于最小p值；表4)突出了其在3月龄(图2e)而非1岁龄(图2f)aw组和对照组的样品之间进行区别的能力。表4：3月龄和1岁龄的aw组和对照组中由picrust预测的前30个差异ko(基于p值)表4(续)ko编号基因名称定义k00341nuolnadh-醌氧化还原酶亚基l[ec:1.6.5.3]k00340nuoknadh-醌氧化还原酶亚基k[ec:1.6.5.3]k00343nuonnadh-醌氧化还原酶亚基n[ec:1.6.5.3]k00342nuomnadh-醌氧化还原酶亚基m[ec:1.6.5.3]k00330nuoanadh-醌氧化还原酶亚基a[ec:1.6.5.3]k00337nuohnadh-醌氧化还原酶亚基h[ec:1.6.5.3]k00339nuojnadh-醌氧化还原酶亚基j[ec:1.6.5.3]k00331nuobnadh-醌氧化还原酶亚基b[ec:1.6.5.3]k00332nuocnadh-醌氧化还原酶亚基c[ec:1.6.5.3]k00333nuodnadh-醌氧化还原酶亚基d[ec:1.6.5.3]k02197ccme细胞色素c型生物合成蛋白cccmek02198ccmf细胞色素c型生物合成蛋白ccmfk02194ccmb亚铁血红素输出蛋白bk02195ccmc亚铁血红素输出蛋白ck00208fabi烯酰-[酰基载体蛋白]还原酶i[ec:1.3.1.91.3.1.10]k06167phnp磷酸核糖1,2-环磷酸磷酸二酯酶[ec:3.1.4.55]k02022abc.mr.txhlyd家族分泌蛋白k13628isca铁-硫簇装配蛋白k03641tolbtolb蛋白k03562tolq生物高分子转运蛋白tolqk02427rlme23srrna(尿苷2552-2'-o)-甲基转移酶[ec:2.1.1.166]k04754mlaa磷脂结合脂蛋白mlaak00029maeb苹果酸脱氢酶(丁酮二酸盐/酯-脱羧基)(nadp+)[ec:1.1.1.40]k13599ntrx双组份系统，氮调控反应调节器ntrxk13598ntry双组份系统，氮调控传感器组氨酸激酶ntrx[ec:2.7.13.3]k07276假定蛋白k01412pmpca线粒体加工蛋白酶亚基α[ec:3.4.24.64]k00830agxt丙氨酸-乙醛酸转氨酶[ec:2.6.1.442.6.1.452.6.1.51]k03667hsluatp-依赖的hsluv蛋白酶atp结合亚基hsluk01419hslvatp-依赖的hsluv蛋白酶，蛋白酶亚基hslv[ec:3.4.25.2]在3月龄的粪便样品中的这种功能差异表明这些菌落影响哮喘发展的潜力。在aw组中菌落的功能差异涉及具有不同代谢功能的基因(即基因复制，碳代谢，转运蛋白，氨基酸生物合成等；表5)。表53月龄的aw组和对照组中由picrust预测的ko中前30个生化途径(基于p值)一旦这些基因组成特定的代谢途径，脂多糖(lps)的生物合成途径是aw组和对照组之间差异最大的(welcht检验，图10)。另外，特定代谢途径的显著差异并未在1岁龄临床组的样品中发现。考虑到绝大多数在3月龄样品中检测到的肠细菌是革兰氏阳性的(除了肠杆菌科(enterobacteriaceae)和韦荣球菌科(veillonellaceae))，因此，韦荣球菌属(veillonella)的种的差异可能导致了aw组lps生物合成基因的差异。通过测定粪便和尿液中scfa的水平，以及尿液代谢组学，进一步调查了aw组儿童肠道菌群的功能影响。aw组3月龄儿童的粪便样品具有显著降低的醋酸浓度(图3a和表6)。表6:3月龄和1岁龄的aw组和对照组的粪便和尿液中的短链脂肪酸nd＝未检测sd＝标准差在哮喘的动物模型中，丙酸盐6，醋酸盐6和丁酸盐14都显示出保护气道免受炎症，这种保护作用被归因于能够防止th2型免疫应答的调节性t细胞(tregs)以及树突状细胞的刺激15。尿液代谢组学分析用于识别宿主和微生物来源的代谢差异16。这一技术已被用于高准确性地区分人17和豚鼠18的哮喘组和对照组。通过比较来自aw组和对照组对象的尿液，在两种表型之间检测到一个微妙但显著的代谢信号(580个测定的代谢物中，39个3月龄的样品显著不同，28个1岁龄的样品不同)。对于本发明的目的，我们主要集中在微生物来源的或贡献的代谢物。在3月龄aw组儿童的样品中，检测到排泄到尿液中的八种受细菌代谢影响的代谢产物不同于对照组，而在1岁龄的样品中，只检测到两种是不同的，再次反映出婴幼儿早期微生物生态失调所带来的影响。在3月龄aw组儿童样品中，硫酸化的胆汁酸甘肽胆酸盐(glycolithocholate)，甘肽胆汁酸酯(glycocholenate)和甘胆酸盐(glycohyocholate)的排泄较高，而tauroursodeoxycholate的排泄下降(图3b)。这种排泄的变化可来源于宿主胆汁酸生成的增加和/或对初级胆汁酸的微生物酶活性的变化。鉴于在aw组儿童肠道微生物群落的几个物种中的差异，很可能是胆汁酸排泄的至少部分差异是由于微生物生态失调19引起的。也许在aw组儿童的尿液中观察到的最显著的代谢差异是肠道菌群的特定产物尿胆原升高了14倍。尿胆原通过血红素代谢的分解产物胆红素的还原来生成。梭菌是唯一已知的能够转化胆红素的细菌20,21，在这项研究中，3月龄aw组样品中梭状芽孢杆菌丰度的降低(ns)(图8)，表明尿胆原排泄的大幅度增加可能是由于宿主胆红素代谢的变化导致的。由于红细胞是特别容易受胆汁酸的膜损伤效应的影响22，aw组较高的胆汁酸水平可能导致胆红素的增加。有趣的是，不像其它胆汁酸，tauroursodeoxycholate在其他胆汁酸存在下，已经显示出对红细胞和肝细胞的细胞保护作用23,24，这与其在对照组中较高的水平相一致(图3b)。在在3月龄aw组儿童的尿中观察到胆汁酸代谢的差异与升高的尿胆原的排泄相关。目前还不清楚这些代谢变化是否以及如何与哮喘的发病机制相关。然而，他们构成了婴幼儿早期可在尿液中检测到并与哮喘风险相关的肠道生态失衡的标志物。在用人源化的微生物引起的小鼠气道炎症的动物模型中，探究了粪杆菌属(faecalibacteriumsp.),毛螺菌属(lachnospirasp.)，韦荣球菌属(veillonellasp.)和罗氏菌属(rothiasp.)(统一简称为flvr)在哮喘易感性中的作用。用来自3月龄aw组对象的粪便，或有意补充活flvr的相同的人接种物对成年无菌(gf)小鼠(n＝4)进行接种。基于这4个类群在3月龄的粪便样品中非常低的丰度，阳性严格的api，以及在3岁前对哮喘的正式诊断，选择这一aw对象。携带flvr的亲代所生的小鼠成功地保留了这些菌株，毛螺菌属(lachnospirasp.)的定殖丰度比其它3种菌株高得多(图4a，b)。用卵清蛋白(ova)免疫7-8周龄的f1代，以诱导气道的炎症反应。接种aw微生物群的小鼠表现出对ova严重的肺部炎症反应，其特征在于，包括嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，巨噬细胞和淋巴细胞的混合肺浸润。然而，在aw微生物群中另外补充flvr能显著降低在支气管肺泡灌洗的总肺细胞浸润(bal；p<0.05)(图4c，d)。组织病理学评分证实，补充flvr能降低气道的炎症(图4e；p<0.01)。此外，补充flvr能显著降低关键促炎细胞因子ifn-γ，tnf，il-17a和il-6以及ova特异性igg2a的浓度(图4f，g；p<0.01-0.0001)。该细胞因子模式令人联想到升高的tnf，il-17a和il-6水平与伴随嗜中性粒细胞水平升高的严重的人哮喘相关25-27。总之，这些数据表明，来自aw样品的微生物群诱导混合th1/th2/th17肺炎症反应，并用flvr刻意进行的治疗性的定殖来显著降低免疫应答中的th1/th17成分。本发明采用一个或多个实施方式来进行说明。然而，对本领域技术人员来说，在不脱离本发明权利要求所限定的范围内所做的多种变化和修改都是显而易见的。所有引文通过引用的方式纳入本文。参考文献：1.worldhealthorganization:asthma,<http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs307/en/>(2013).2.graham-rowe,d.lifestyle:whenallergiesgowest.nature479,s2-s4(2011).3.russell,s.l.etal.earlylifeantibiotic-drivenchangesinmicrobiotaenhancesusceptibilitytoallergicasthma.emboreports13,440-447,doi:10.1038/embor.2012.32(2012).4.russell,s.l.etal.perinatalantibiotictreatmentaffectsmurinemicrobiota,immuneresponsesandallergicasthma.gutmicrobes4,158-164,doi:10.4161/gmic.23567(2013).5.arrieta,m.c.,stiemsma,l.t.,amenyogbe,n.,brown,e.m.&finlay,b.theintestinalmicrobiomeinearlylife:healthanddisease.frontimmunol5,427,doi:10.3389/fimmu.2014.00427(2014).6.trompette,a.etal.gutmicrobiotametabolismofdietaryfiberinfluencesallergicairwaydiseaseandhematopoiesis.naturemedicine20,159-166,doi:10.1038/nm.3444(2014).7.castro-rodriguez,j.a.,holberg,c.j.,wright,a.l.&martinez,f.d.aclinicalindextodefineriskofasthmainyoungchildrenwithrecurrentwheezing.americanjournalofrespiratoryandcriticalcaremedicine162,1403-1406,doi:10.1164/ajrccm.162.4.9912111(2000).8.castro-rodriguez,j.a.,cifuentes,l.&rodriguez-martinez,c.e.theasthmapredictiveindexremainsausefultooltopredictasthmainyoungchildrenwithrecurrentwheezeinclinicalpractice.thejournalofallergyandclinicalimmunology127,1082-1083,doi:10.1016/j.jaci.2011.01.024(2011).9.hoskin-parr,l.,teyhan,a.,blocker,a.&henderson,a.j.antibioticexposureinthefirsttwoyearsoflifeanddevelopmentofasthmaandotherallergicdiseasesby7.5yr:adose-dependentrelationship.pediatricallergyandimmunology:officialpublicationoftheeuropeansocietyofpediatricallergyandimmunology24,762-771,doi:10.1111/pai.12153(2013).10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