一种临床研究血浆样品中喹硫平浓度的分析方法与流程

　　

　　本发明涉及一种临床研究血浆样品中喹硫平浓度的分析方法。

　　背景技术：

　　富马酸喹硫平缓释片是一种非典型抗精神病药物，对多种神经递质受体有相互作用。由阿斯利康制药有限公司开发，2007获fda获批上市，成为fda批准的治疗精神分裂症类药物。为了支持喹硫平的临床研究以及仿制药的研发，需要一种检测人血浆样品中喹硫平浓度的方法。目前用于检测喹硫平在生物基质中的浓度的相关技术披露较少。液相色谱-串联质谱联用法(lc-ms/ms)由于其优异的选择性、灵敏度、通量及适用性被广泛的用于生物基质中药物浓度测定。本发明基于lc-ms/ms技术，开发了检测临床研究血浆样本中喹硫平的浓度方法。

　　技术实现要素：

　　为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种临床研究血浆样品中喹硫平浓度的分析方法。

　　为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

　　一种临床研究血浆样品中喹硫平浓度的分析方法包括以下步骤：

　　步骤1：血浆样品前处理，向96孔板中加入血浆样品，内标溶液和乙腈，涡流振荡，离心，取出上清转移至96孔板中，进行lc-ms/ms分析；

　　步骤2：色谱分离；

　　色谱条件，色谱柱：xdb-c18柱，1.8μm，50×4.6mm；进样量：1μl；柱温：40℃；流动相a相选用10mm醋酸铵水溶液含0.1％甲酸，流动相b项为乙腈含0.1％甲酸，采用体积比为40：60的a：b相等度洗脱；自动进样器温度为4℃，流动相的流速为：0.5ml/min；

　　步骤3：质谱检测；

　　质谱条件：电喷雾电离源；电压为5500v；离子源温度为500℃；curtaingas和cid压力分别为35和9psi；扫描模式为+mrm；监测离子反应分别为：喹硫平，m/z384.1→m/z279.2；喹硫平-d8，m/z392.2→m/z286.1；ce为38ev；dp为80v；扫描时间为250ms。

　　优选地，步骤1血浆样品前处理，取50.0μl血浆样品，分别加入50.0μl内标工作液、500μl甲醇，涡流10min，以4500rpm转速离心10min，取出上清200μl转移至96孔板中，取1.00μl进行lc-ms/ms分析。

　　借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

　　1、本发明采用简单的蛋白沉淀法处理血浆样品，且没有复杂的浓缩过程，前处理通量较高。

　　2、本发明检测方法灵敏度较高，浓度为2.00ng/ml定量下限样品信噪比约为69、检测限经计算约为0.100ng/ml，且色谱进样量仅为1.00μl。

　　3、本发明针对检测喹硫平血浆浓度仪器分析速度快，色谱运行时间仅为2min。

　　附图说明

　　为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

　　图1是本发明喹硫平的产物离子全扫描质谱图；

　　图2是本发明的内标喹硫平-d8的产物离子全扫描质谱图；

　　图3是本发明的喹硫平(左)和喹硫平-d8(右)在人血浆中空白人血浆样品的mrm色谱图；

　　图4是本发明喹硫平(左)和喹硫平-d8(右)在定量下限样品中的mrm色谱图；

　　图5是本发明1名受试者口服富马酸喹硫平缓释片后药物浓度-时间曲线。

　　具体实施方式

　　结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

　　液相色谱-串联质谱检测血浆中药物浓度的方法开发通常可分为三个部分，即提取方法(即预处理方法)、液相色谱方法和质谱方法。本发明针对现有技术缺点，从以上这三个方面着手建立分析方法。

　　实施例

　　如图1和图2所示，一种临床研究血浆样品中喹硫平浓度的分析方法，包括以下步骤：

　　步骤1：血浆样品前处理，向96孔板中加入血浆样品，内标溶液和乙腈，涡流振荡，离心，取出上清转移至96孔板中，进行lc-ms/ms分析；

　　步骤2：色谱分离；

　　色谱条件，色谱柱：xdb-c18柱，1.8μm，50×4.6mm；进样量：1μl；柱温：40℃；流动相a相选用10mm醋酸铵水溶液含0.1％甲酸，流动相b项为乙腈含0.1％甲酸，采用体积比为40：60的a：b相等度洗脱；自动进样器温度为4℃，流动相的流速为：0.5ml/min；

　　步骤3：质谱检测；

　　质谱条件：电喷雾电离源；电压为5500v；离子源温度为500℃；curtaingas和cid压力分别为35和9psi；扫描模式为+mrm；监测离子反应分别为：喹硫平，m/z384.1→m/z279.2；喹硫平-d8，m/z392.2→m/z286.1；ce为38ev；dp为80v；扫描时间为250ms。

　　上述质谱条件中，选择+mrm扫描模式，因为喹硫平正离子响应较好、正离子模式下干扰峰较少、信噪比较高，因此最终选择正离子扫描模式。

　　实施例一

　　缩写说明

　　1材料

　　1.1仪器

　　日本岛津公司lc-30ad超高效液相色谱系统及absciextriplequadtm6500+型三重四级杆串联质谱仪，配有esi源。

　　数据处理采用analyst1.6.3软件。

　　北京赛多利斯仪器有限公司cp225d型分析天平。

　　日本贺默公司z326k型台式离心机

　　德国eppendorf公司5424r小型高速冷冻离心机。

　　1.2标准品和试剂

　　富马酸喹硫平(含量99.8％)；富马酸喹硫平-d8(含量99.0％、同位素纯度98.8％)；甲醇采购于美国sigma公司；甲酸采购于日本tci公司；醋酸铵采购于美国roe公司；去离子水由millipore纯水仪制备。上述试剂均为色谱纯。

　　2方法

　　2.1溶液的配制

　　标准曲线样品配制

　　称取富马酸喹硫平对照品，以甲醇溶解并定容，浓度约为1.00mg/ml。吸取上述喹硫平贮备液适量，以甲醇-水(50/50，v/v)逐级稀释得到系列浓度标准溶液，喹硫平浓度分别40.0、80.0、200、600、2000、4000、8000、10000ng/ml。以空白血浆稀释上述工作溶液获得喹硫平浓度分别2.00、4.00、10.0、30.0、100、200、400和500ng/ml的标准曲线样品。

　　内标工作液

　　称取富马酸喹硫平-d8对照品，以甲醇溶解并定容。精密吸取内标贮备液适量，以甲醇-水(50/50，v/v)分步稀释，获得浓度为20.0ng/ml的内标工作液。

　　2.2血浆样品处理

　　取50.0μl血浆样品，分别加入50.0μl内标工作液、500μl甲醇，涡流10min，以4500rpm转速离心10min，取出上清200μl转移至96孔板中，取1.00μl进行lc-ms/ms分析。

　　2.3色谱及质谱条件

　　色谱条件

　　质谱条件

　　2.4方法学验证

　　选择性

　　分别取空白人血浆、lloq样品和受试者服用200mg富马酸喹硫平缓释片后的血浆样品处理分析，得相应色谱图(图3和图4)。喹硫平和内标喹硫平-d8的保留时间均为1.09min，空白血浆谱图中该保留时间处无干扰峰。

　　标准曲线

　　以喹硫平理论浓度为横坐标(x)，喹硫平与喹硫平-d8峰面积比为纵坐标(y)，进行直线回归计算(权重因子w＝1/x2)，喹硫平的典型回归方程为y＝0.0345x+0.00187，r＝0.9985，喹硫平在2.00～500ng/ml范围内明显线性。

　　准确度、精密度及稳定性

　　以人空白血浆，稀释喹硫平贮备液，配制成lqc、mqc、hqc(喹硫平浓度为6.00、30.0和375ng/ml)以及lloq(喹硫平浓度为2.00ng/ml)，方法验证每一分析批测定四浓度质控样本各六样本。lloq日内、日间精密度以相对标准差(rsd)<20％方可接受，准确度(re)在-20％～20％之间方可接受。其余各浓度水平的qc样品各成分日内、日间精密度(rsd)<15％方可接受，准确度(re)在-15％～15％之间方可接受。

　　见表1，结果表明本方法测定喹硫平的精密度和准确度均可接受，喹硫平的lloq为2.00ng/ml。

　　表1

　　取lqc和hqc样品，考察其室温放置20h、反复冻融5次以及-70℃放置41天的稳定性。

　　见表2，结果表明，在上述条件下喹硫平均稳定，re在-6.4％～-2.7％之间。

　　表2

　　回收率与基质效应

　　分析低、中、高浓度的qc样品个六样本。同时另取空白血浆50.0μl，按血浆样品处理，向上清液中加入喹硫平对照溶液及内标工作液，涡流混合，进样测定，2种样品中的喹硫平平均峰面积比即为回收率。结果表明，三浓度水平提取回收率分别为99.9％、100.9％、101.8％，不同浓度水平cv％分别为1.3％、0.7％、1.7％。内标回收率为96.2％。

　　取不同来源人空白血浆(n＝6)，按血浆样品处理(不加入内标)，向上清液中加入对照溶液和混合内标工作液，进样测定。另取50.0μl去离子水，按上述方法处理，进样测定。以两种样品喹硫平峰面积比值计算基质因子。喹硫平在lqc和hqc浓度下基质因子分别为97.3％和94.5％，其rsd均小于2.0％，表明在本试验条件下，可忽略基质效应对喹硫平测定的影响。

　　方法验证总结

　　本发明方法经过方法学验证，方法灵敏度极高、选择性好、准确度、精密度、稳定性好、线性良好，各项指标均符合2015年中国药典附录《9012生物样品定量分析方法验证指导原则》要求

　　药动学研究

　　将本发明测定血浆中喹硫平的浓度，用于喹硫平片人体药动学研究。临床研究经过医院伦理委员会批准，受试者在试验前均被告知试验风险，自愿签署知情同意书。健康受试者给予200mg富马酸喹硫平缓释片。于给药前(0h)、给药后不同时间点，静脉取血，置抗凝离心管中，离心后分离血浆进行测定。如图5所示，其中一名受试者药物浓度-时间曲线。本发明可用于喹硫平片人体药动学研究及生物等效性研究。

　　本发明至少具有以下优点：

　　1、本发明采用简单的蛋白沉淀法处理血浆样品，且没有复杂的浓缩过程，前处理通量较高。

　　2、本发明检测方法灵敏度较高，浓度为2.00ng/ml定量下限样品信噪比约为69、检测限经计算约为0.100ng/ml，且色谱进样量仅为1.00μl。

　　3、本发明针对检测喹硫平血浆浓度仪器分析速度快，色谱运行时间仅为2min。

　　以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。