【文献综述】婴幼儿配方奶粉中强化维生素B12的检测技术研究（12页）

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　　文献综述

　　婴幼儿配方奶粉中强化维生素B12的检测技术研究

　　1 前言

　　根据国内外相关资料，目前现检测维生素B12主要有4种方法：高效液相色谱串联质谱法、微生物法[1-2]、高效液相色谱法［3］及荧光光度法。其中微生物法是通用方法。微生物法的优点是灵敏度高，但因为该法操作的技术点多，孕育周期长，成本高等缺点而不能在实验室里普及，只有少数质检机构选用。由于奶粉(主要针对允许强化维生素B12的婴幼儿配方奶粉与调制奶粉)中的维生素B12含量较低、基质较复杂，采用原子吸收法、高效液相色谱法等方法的检出限很难满足定量测定要求。所以对于含量低，低于仪器检出限，无法采用仪器方法时，仍然需要采用微生物法进行测定。公职分析化学家协会(AOAC）和美国药典(USP)和中国国家标准GB/T5413.14-2010将微生物法作为测定维生索B12的主要方法和仲裁方法，而仪器方法作为辅助方法。目前已有研究将液相色谱－质谱联用对［4］维生素B12的检测，但由于仪器昂贵、技术难度大及准确性差等缺点难以在企业中普及。近年来出现的试剂盒测定方法也因重现性差、回收率低、成本高等缺点较难推广，采用固相萃取技术测定维生素B12时，由于有些样品净化不够理想、有干扰，尤其是奶粉等基质干扰比较大的样品测定效果更不理想。国家标准中规定的维生素B12含量在婴幼儿配方食品中最低为8.0 μg/kg［5］。

　　1.1 维生素B12的特性及功能

　　维生素B12又称氰钴素和钴胺素，是一种由含钴的卟啉类化合物组成的B族维生素。维生素B12为浅红色的针状结晶，易溶于乙醇和水，在pH值4.5 - 5.0弱酸条件下能够稳定存在，强酸（pH < 2）或碱性溶液中容易分解，遇热会受到一定程度的破坏，但在短时间内的高温消毒损失不大，遇紫外线或强光容易被破坏。维生素B12广泛存在于动物食物中，如牛奶、动物肝脏、蛋、牛肉、奶酪等。人体对维生素B12的需求量是所有必需维生素中最少的，每天3μg就能满足人体的需求。维生素B12的重要的生理功能有两个：①作为甲基转移酶的辅因子，参与蛋氨酸和胸腺嘧啶等的合成，因此维生素B12可促进蛋白质的生物合成，缺乏时会对婴幼儿的生长发育有影响。②保护叶酸在细胞内的贮存和转移，维生素B12缺乏时则会影响到叶酸的利用受，导致人体周围神经炎。儿童缺少维生素B12的初期表现是表情呆板、情绪异常、反应迟钝，最终致使贫血。

　　2 国内外对维生素B12的检测方法

　　2.1 微生物法

　　微生物分析法测定维生素B12的研究工作在国际上已经有几十年的历史了, 是较为原始也是最早的方法, 在美国发展的尤其迅速,但是我国这方面的报导还不是很多。到目前为止，美国药典（USP）、公职分析化学家协会（AOAC）和中国国家标准GB/T5413.14-2010都将微生物法作为作为检测维生索B12的仲裁和主要方法。微生物法的高灵敏度和可靠性已得到国际权威机构的认同。

　　2.1.1 基本原理

　　微生物法是食品国家安全标准（GB/T5413.14-2010）对婴幼儿乳品和食品中维生素B12的测定方法，检测限为0.1 μg/100 g，适合维生素B12含量低样品的测定。微生物法的基本原理是利用莱士曼氏乳酸杆菌对维生素B12的灵敏性和特异性，定量检测出样品中维生素B12的含量。在检测用的培养基中加入除维生素B12之外的全部营养成分，这样微生物生长所产生的透光率就会同标准工作液和未知待测液中维生素B12含量相对应了。以不同浓度标准溶液的透光率相对各标准物质的浓度绘制标准工作曲线，根据标准曲线便可测定试样中维生素B12的浓度，从而计算出试样中维生素B12的含量。

　　2.1.2 分析方法

　　测试菌液的制备：将活化好的莱士曼氏乳酸杆菌接种到乳酸杆菌琼脂培养基上，在36 ± 1℃温度下培养24 h。再转种2～3代来增强活力。置温度在2 - 5℃冰箱保存备用。每15 d需转种一次；将活化好的菌株接种到乳酸杆菌肉汤培养基中，在36 ± 1℃温度下培养18 h - 24 h，以转速2000 r/min,离心2 min - 3min，除去上清液，加入10 mL生理盐水（9 g/L），混匀，如上离心操作2次，然后除去上清液。再加10 mL 生理盐水，混匀。吸适量该菌悬液置于10 mL生理盐水中，混匀制备成测定菌液。用分光光度计，以生理盐水做为空白，在550 nm波长下测试菌液的透光率，要求其透光率在60% - 80%之间。

　　样品的前处理：称一定量的样品 (精确到± 0.0001 g)，用10 mL 的溶液（称取1.3 g无水磷酸氢二钠，1.0 g无水偏重亚硫酸钠，1.2 g柠檬酸，用100 mL水溶解）混合后，再加150 mL水，于121 ℃温度下水解10 min，冷却后调pH至4.5 ± 0.2，再用水定容至250 mL，过有