北京协和医院：脊椎脊柱侧凸小鼠模型的评价与验证

　　

　　Tbx6基因敲除骨骼畸形小鼠模型评价与验证方法

　　1. Tbx6亚效等位基因的建立

　　Tbx6基因调控区域的8个碱基敲除获得mh等位基因(A)，所采用的gRNA在luciferase显示亚效等位基因的转录活性(C)，in situ显示Tbx6 mh纯合小鼠尾端的Tbx6表达下降(D)。Yang et al., Hum Mol Genet. 2019 Feb 15;28(4):539-547.

　　2. TACS小鼠的表型评估。

　　胚胎期E14.5野生型和TACS小鼠的阿尔新兰染色结果，提示椎体和肋骨的异常(AB)。发生率在不同基因型的小鼠中如C所示。

　　3. TACS小鼠microCT

　　成年小鼠的背面和腹侧观，可见半椎体及脊柱侧弯的表型，以及部分肋骨融合(AB)。不同基因型的脊柱表型统计在C。

　　4. 动物模型的评价与验证

　　涉及Tbx6基因敲除小鼠的动物模型实验包括新生小鼠及鼠胚胎的基因型验证、骨骼染色、骨骼组织的石蜡及冰冻切片染色、microCT扫描等等。评价指标包括脊柱及肋骨的畸形状态、胚胎骨骼发育情况等等。

　　(1)小鼠基因型鉴定

　　? 取新生小鼠(P0到P10)鼠耳耳标组织，置于EP管中，加入75 μl碱性裂解液并金属浴95摄氏度加热15 min；

　　? 冰上冷却1 min，加入75 μl中和液获得DNA原液；

　　? 按照MasterMix配方制备PCR体系，进行PCR；

　　? 跑胶，切胶回收目的条带，提纯sanger测序。

　　(2)骨骼染色

　　? 二氧化碳法处死小鼠，剥离全部皮肤及内脏，小心去除脂肪组织；

　　? 置于95%乙醇溶液室温过夜；

　　? 乙醇更换为100%乙酮室温过夜，去除多余的脂肪组织，在关节处用针头戳若干小孔；

　　? 更换100%乙酮为阿尔欣兰染液(0.03% in 80% ethanol and 20% glacial acid)，根据样本周龄室温浸染1-3天；

　　? 更换染液为0.05%茜素红染液(1%KOH)，根据样本周龄室温浸染1-3天；

　　? KOH脱色透明化1-3天，待软组织透明化后梯度更换为Glycerol KOH溶液。

　　(3)骨骼组织石蜡切片

　　? 骨骼组织分离，4%PFA于4摄氏度固定过夜

　　? PBS洗三遍，进行EtOH脱钙15天

　　? 上自动脱水机进行脱水与石蜡预浸润

　　? 石蜡包埋，切片

　　(4)骨骼组织冰冻切片

　　? 骨骼组织分离，4%PFA于4摄氏度固定过夜

　　? PBS洗三遍，进行EtOH脱钙15天

　　? 30%蔗糖溶液脱水，optium预浸润

　　? 冰冻包埋，切片

　　

　　TBX6相关先天性脊柱侧凸小鼠模型的评价与验证

　　1. 剂量依赖性的先天性椎体畸形复合遗传模型

　　使用小鼠胚胎的体内测定，我们展示了剂量依赖性的先天性椎体畸形复合遗传模型。该模型由Tbx6无效等位基因(?)和亚等位基因(mh)组成。(A)阿尔新蓝染色的E14.5小鼠胚胎的背面视图。显示了一个没有明显椎体畸形的胚胎。(B)显示了一个具有椎体畸形的胚胎。红点和箭头分别表示椎体畸形和肋骨融合。比例尺为1 mm。(C)在Tbx6+/+，Tbx6+/mh，Tbx6 mh/mh或Tbx6+/?的E14.5小鼠胚胎中未观察到明显的椎体畸形，而Tbx6 mh/?胚胎表现出高穿透率的椎体畸形。样本量显示在下面的列中。****，P<0.0001。

　　2. 成年小鼠的Micro-CT结果

　　(A)通过Micro-CT扫描显示成年小鼠的背侧和腹侧图像，未见明显椎体畸形。(B)通过Micro-CT扫描显示一只具有椎体畸形的小鼠。白色箭头和箭头分别指示椎体畸形和肋骨融合。(C)Tbx6+/+，Tbx6+/mh，Tbx6 mh/mh，Tbx6+/+和Tbx6 mh/?基因型的成年小鼠Micro-CT图像。样本量显示在每列下方。****，P<0.0001。

　　信息来源：国家动物模型资源共享平台

　　

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