五味子醇甲代谢物及其在制备抗特发性肺纤维化的药物中的应用的制作方法

　　1.本发明涉及医药技术领域，具体地说，是五味子醇甲代谢物及其在制备抗特发性肺纤维化的药物中的应用。背景技术：2.特发性肺纤维化(ipf)是一种慢性、进行性、纤维化间质性肺炎，临床表现为进行性加重的呼吸困难伴限制性通气功能障碍和气体交换障碍，严重会导致低氧血症甚至呼吸衰竭。ipf预后差，死亡率高，患者确诊后平均生存期仅为2.8年。很大一部分患者在疾病开始时没有任何症状，并且在就诊时已经处于疾病的中晚期。值得注意的是，肺部感染严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(sars-cov-2)(covid-19的病原体)后，可导致一些患者出现弥漫性肺泡损伤(dad)，随后发生纤维化重塑和持续的氧合减少。此外covid-19愈后并发症可能包括ipf的发展。除肺移植外，ipf尚无有效疗法，早期用于治疗肺纤维化的糖皮质激素、n-乙酰半胱氨酸和环磷酰胺等药物因疗效差和药物不良反应(adr)而未得到推荐。新药尼达尼布和吡非尼酮可以延缓用力肺活量(fvc)下降速度，延缓疾病进展，但这些药物价格昂贵，存在不良反应，导致患者耐受性差。近年来，以五味子为突出代表的中药(tcm)在ipf的治疗中发挥了积极作用。3.五味子在中国有着悠久的药用历史，据汉代《神农本草经》和明代《本草纲目》记载，五味子味酸，性温，用于治疗咳嗽气喘，有润肺补肾之功效。可从中分离出木脂素、挥发油、多糖、三萜、有机酸、氨基酸等多种化学成分。多项研究表明，其中木脂素类成分可以改善ipf患者的临床症状，提高生活质量，增加患者的运动耐量，延长生存期，部分改善肺功能。此外，木脂素提取物还能抑制一系列纤维化相关的生物过程，包括炎症、细胞增殖和迁移。其中，有研究其活性成分的抗纤维化作用及其机制可能是：五味子乙素通过抑制emt减轻angii介导的动脉血管重构和纤维化表型；五味子醇乙和五味子乙素抑制tgf-β1介导的nf-κb信号通路，有望用于治疗或预防血管纤维化疾病；五味子乙素通过zeb1的表观遗传沉默阻止a549细胞中的tgf-β1刺激emt；五味子乙素和甘草酸通过抑制tgf-β1/smad2通路和nox4过表达协同预防博来霉素诱导的肺纤维化；除五味子乙素和五味子醇乙外的其他木脂素成分也具有抗肺纤维化作用，但其具体机制尚不清楚。此外，关于五味子在体内过程的研究很少，目前有研究鉴定出大鼠灌胃五味子甲素后的51种代谢物。也有一些相关五味子有效成分的体外和体内分析方法的文献。4.现有技术：肺复康合剂化学成分及含量测定研究(任燕，陈向明等，doi：10.13863/j.issn1001-4454.2016.08.028)记载了：目的:鉴定肺复康合剂中的主要化学成分并测定其含量。方法：采用液-质联用技术,通过与对照品的保留时间、质谱数据进行比对,确定化学成分。同时采用hplc法对各成分进行含量测定。结果:鉴定出5种化学成分:新芒果苷、芒果苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、五味子醇甲。含量测定研究中,上述5种成分分别在2.08104.0μg/ml、2.00100.0μg/ml、2.00100.0μg/ml、2.09104.5μg/ml、1.9899.0μg/ml浓度范围内与各自峰面积呈良好的线性关系,平均加样回收率均在91.3％103.8％。结论:该实验结果为揭示肺复康合剂的药效物质基础及质量控制奠定基础。5.而本研究将uplc-q-tof/ms与网络药理学和体外实验验证相结合，以血清药化学为基础，鉴定五味子中影响ipf的潜在活性木酚素成分，探索其活性物质和药理作用。关于本发明五味子醇甲代谢物及其在制备抗特发性肺纤维化的药物中的应用目前还未见报道。技术实现要素：6.本发明的目的是针对现有技术的不足，提供五味子醇甲代谢物及其在制备抗特发性肺纤维化的药物中的应用。7.为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：8.第一方面，本发明提供了一种化合物，所述化合物为：c24h30o7，所述化合物如式(i)所示：[0009][0010]第二方面，本发明提供了如上所述化合物在制备抗特发性肺纤维化的药物中的应用。[0011]优选地，所述抗特发性肺纤维化指调节α-sma和e-cadherin的表达量。[0012]优选地，所述抗特发性肺纤维化指降低肺组织中羟脯氨酸水平。[0013]优选地，所述抗特发性肺纤维化指化合物与tgfbr1结合，调节调节α-sma和e-cadherin的表达量。[0014]优选地，所述药物包括药学上可接受的载体。[0015]第三方面，本发明提供了一种同时检测两种以上化合物的方法，所述方法其色谱条件为：uplc色谱柱(2.1×150mm，1.9μm)，柱温为45℃，进样量为5μl，流速为0.3ml/min，梯度洗脱程序为：[0016]时间(min)a相(0.1％甲酸)b相(甲醇)0-2010％-35％65％-90％20-22.55％-10％90％-95％22.5-23.50％-5％95％-100％23.5-250100％。[0017]优选地，所述化合物指五味子木脂素类成分化合物。[0018]本发明优点在于：[0019]1、本发明基于血清药化学的基础探究了木脂素的生物转化和药理活性，首次通过网络药理学建立了m21抗ipf的网络关系，表明五味子醇甲及其氧化-酮形成代谢物m21主要通过调节tgf-β信号通路发挥抗纤维化作用。分子对接分析和体外实验证实了m21可以通过与tgfbr1结合调节α-sma和e-cadherin的表达来影响emt。结果表明，五味子醇甲的代谢物m21比其他化合物具有更好的抗ipf活性。为了解五味子的生物活性化合物及药理机制提供了理论支持。[0020]2、本发明通过实验发现了一种新的化合物m21，实验结果表明该化合物有望成为治疗特发性肺纤维化一种新型药物，实用性强，应用前景广。附图说明[0021]附图1是uplc-q-tof/ms在esi+模式下(a)五味子木脂素类(b)标准品的提取离子色谱图。[0022]附图2-1是：(a)0.5h口服sch后吸收的木脂素的化学结构和提取离子色谱图，附图2-2是(b)1.5h、(c)5h口服sch后吸收的木脂素的化学结构和提取离子色谱图。[0023]附图3-1、3-2、3-3分别是(a)五味子酯甲、(b)五味子酯乙、(c)五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素推测的主要代谢途径。[0024]附图4-1、4-2分别是(a)成分-核心靶点对接，结合位点为lys-232和his-283。(b)通过实时聚合酶链反应(qrt-pcr)测定nih/3t3中-sma和e-钙粘蛋白的mrna。(c、d)-sma和e-钙粘蛋白在nih/3t3中的表达通过蛋白质印迹确定。五味子醇甲的浓度为3mm、10mm和30mm。尼达尼布(5mm)用作阳性对照。化合物的纯度为98％。*p《0.05，**p《0.01与对照组。[0025]附图5是五味子醇a可减弱blm诱导的小鼠肺纤维化。(a)建立blm诱导肺纤维化模型及给药方案。(b)不同组的体重下降。(c)右肺组织羟脯氨酸水平。(d)肺组织masson染色(胶原沉积为蓝色，放大倍数为100和200)。比例尺:50um。[0026]附图6-1、6-2代表性代谢物的离子色谱提取图。(a)m1、(b)m10(c)m21,(d)m26,(e)m27和(f)m29。[0027]附图7是吸收入血木脂素及其代谢物(a)五味子酯甲、五味子素酯乙及相应代谢物，(b)五味子素甲素、五味子素乙素、五味子醇甲及相应代谢物的adme boiled-egg模型。[0028]附图8(a)五味子和ipf相关靶点的维恩图。(b)药物和疾病之间重叠靶标的蛋白质-蛋白质相互作用(ppi)网络，圆圈的大小代表相关程度。(c)药物与疾病重叠靶点的相邻节点数，x轴表示靶点相邻蛋白的数量，y轴表示不同靶点。[0029]附图9是复合-靶点-疾病(ctd)网络图。具体实施方式[0030]下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。[0031]实施例1[0032]1材料和方法[0033]1.1材料和试剂[0034]五味子由上海万世诚中药制品有限公司提供(五味子来自中国甘肃省。编号20201223)。标准品五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素购自元业生物科技有限公司(上海，中国)，化合物的纯度为98％。甲醇和乙腈(均为液相色谱级)购自merck(德国达姆施塔特)。二甲基亚砜(dmso)购自sigma-aldrich(中国上海)。醋酸铵和甲酸购自anpel lab tech。(上海，中国)。该测定中的纯水(18.2mω/cm)通过milli-q系统(millipore,bedford,ma,usa)去离子。所有溶液在使用前都经过超声波脱气。[0035]1.2制备五味子样品[0036]称取五味子(300g)用水煎煮两次(每次2小时)，然后合并两次煎剂并过滤。静置后，取上清液浓缩成透明乳状液，相对密度为1.16～1.22(60℃)。将2倍量的乙醇加入澄清的糊状物中，充分搅拌，静置24小时，然后过滤。滤渣用60％乙醇洗涤，合并洗涤液与滤液，最后旋蒸挥去乙醇，浓缩成相对密度为1.36(50℃)的稠膏。[0037]1.3动物实验[0038]无病原体雄性sprague-dawley大鼠(180-200g)由上海斯莱克实验动物有限公司提供(中国上海，批准文号：2021-0008)。将大鼠饲养在动物房(24±2℃，60±5％相对湿度)中，设置12小时的暗/光循环。动物研究是根据实验动物护理和使用指导原则进行的。实验前，给大鼠自由饮食、饮水一周以适应环境。大鼠分为对照组和五味子给药组(每组6只)。制备的五味子样品(溶于纯净水，0.15g/ml)以1ml/100g(剂量体积/体重)的剂量每日给与大鼠灌胃两次，持续7天。对照组大鼠给予等体积生理盐水。[0039]1.4血浆收集和前处理[0040]分别于最后一次给药后0.5h、1.5h、5h眼眶取血500μl，加入事先滴有肝素钠的eppendorf管中，在4℃下以6500rpm离心10分钟，然后将血浆样品转移到干净eppendorf管中并储存在-80℃以备进一步分析。血浆样品前处理：200μl血浆中加入800μl甲醇沉淀蛋白质，然后涡旋混合3分钟，在4℃，14000rpm条件下离心10分钟。随后将上清液转移到另一eppendorf管中，蒸发挥干。最后50μl60％甲醇复溶，并在4℃，14,000rpm条件下离心10分钟后进样分析。[0041]1.5 uplc-q-tof/ms分析[0042]在配备安捷伦uplc色谱柱(poroshell 120 ec-c182.1×150mm，1.9μm)的agilent 1290 infinity uplc系统(美国马萨诸塞州米尔福德)上分析样品。流动相为：(a)0.1％甲酸水溶液和(b)甲醇，优化后的梯度洗脱方案如下：0-20min，65％-90％b；20-22.5min，90％-95％b；22.5-23.5min，95％-100％b；23.5-25min，100％b。posttime：1min，流速为0.3ml/min，柱温为45℃进行分析。进样量为5μl。[0043]agilent 6545 q-tof-ms/ms使用双安捷伦喷射流电喷雾电离源(esi)。在正离子模式下，具有以下条件：扫描范围，100-1000m/z(ms)和50-800m/z(ms/ms)；碎裂电压，175v；气体温度，320℃；雾化器气压，35psig；鞘气温度，350℃；鞘气流量，11l/min；抽气流量，8l/min。在数据采集期间进行了自动校准。为了获得代谢物的碎片信息，在ms/ms模式下使用氩气作为碰撞气体，碰撞能量在10-40ev(从低能量到高能量)的交替电压下运行。[0044]1.6数据分析策略[0045]通过agilent masshunter定性分析(b.10.00版)使用自建pcdl库分析全扫描后ms和(所有离子和目标)ms/ms数据集，该库包含已知或假设的植物化学成分(主要是木酚素)化学式和相应的代谢物。(1)分子特征提取(mfe)和按公式查找(fbf)参数如下：质量误差《10ppm，绝对峰面积》5000counts，最大匹配数5，色谱提取窗口20ppm。(2)基于以下标准进一步评估代谢物：质子化分子的质量误差小于5ppm，包含同位素，ms/ms产物离子与与母体组分相似的推测结构一致(通过动态质量缺陷过滤器)，推测结构保留时间合理(使用clog p计算辛醇/水分配系数)，适当的峰形，阴性对照中没有相同的峰，去除实验中存在但似乎随机增加浓度的代谢物(有显着波动或仅在一种情况下存在)。[0046]1.7与鉴定化合物相关的靶基因[0047]由于血浆中吸收的成分更可能是生物活性化合物，因此利用uplc-q-tof/ms鉴定的原型成分和代谢物构建了五味子的化学信息数据库，用于网络药理学研究。从pubchem(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/)下载原型化合物的分子文件，用chemdraw绘制代谢产物。所有结构均以mol2格式保存。从swisstargetprediction(http://www.swisstargetprediction.ch)得到这些化合物的目标。选择了具有高拟合分数(z-score》0.5)的药物来提高目标预测结果的可靠性。[0048]1.8潜在靶基因[0049]只选择“人”的蛋白质从omim(https://omim.org)和genecards database(http://www.genecards.org/)得到ipf目标基因的信息。使用metascape数据库(https://metascape.org/)进行基因和kegg的功能注释。[0050]1.9构建网络[0051]用cytoscape(ver.3.7.1)构建了复合—靶—疾病(ctd)网络和潜在靶基因相关通路网络。ctd网络中的节点代表药物、目标和疾病，边表示药物与目标基因或目标与疾病之间的相互作用。计算“度”以证明节点的拓扑重要性。[0052]1.10分子对接分析[0053]这项研究旨在确定活性成分与其蛋白质靶标之间的相互作用，并探索它们的结合模式。因此，选择了8种核心成分及其代谢物，作为分子对接验证的两个核心目标。用autodock tools(ver.1.5.6)做成分—目标分子对接。[0054]1.11数据分析[0055]所有数据均用平均值±sd表示。用graphpad prism(第8版；graphpad software,la jolla,ca)分析和说明结果。在各自的图例中描述统计显着性(*p《0.05，**p《0.001，单向方差分析)。[0056]2结果[0057]2.1 uplc-q-tof/ms从五味子中筛选木脂素类化合物[0058]弄清木脂素复杂的化学成分对于探究木脂素及其代谢物在体内的吸收情况十分重要。首先，根据文献，总结并建立了五味子成分的数据库(主要是木脂素类)。从chemspider获得化合物名称、分子式、精确分子量和化学结构(表1-1)为了获得更高的峰容量、更短的保留时间和更好的分离度，对uplc-q-tof/ms条件进行了优化。并对其中38种木脂素进行了定性分析。[0059]通过与标准品的比较来鉴定所有的已知化合物。参考以往uplc-q-tof/ms相关的文献，根据其色谱和光谱数据对未知化合物的结构进行初步表征。在esi+模式下，通过uplc-q-tof/ms分析，从五味子和标准品溶液中得到了29种木脂素类化合物的提取离子色谱图(如图1和表1所示)。最终鉴定了29种木脂素，并作出了其中7种标准品的ms/ms数据和裂解图。对于木脂素类化合物，它们的准分子离子为[m+h]+、[m+na]+。由于核心化学结构中的酚羟基，还产生了大量的[m+h-h2o]+离子。这有利于进一步发现口服后吸收的木脂素。但木脂素c11/12、c18/19、c20/21/22是同分异构体，本研究中未能完全阐明，后续会对木脂素类化合物的定性和定量分析做更多的研究。[0060]表1-1用uplc-q-tof/ms构建北五味子木脂素文库[0061][0062][0063]表1-2 uplc-q-tof/ms表征五味子木脂素类成分化合物[0064][0065]2.2大鼠血浆中的木脂素类化合物和相应代谢物的鉴定[0066]2.2.1木脂素类化合物的鉴定[0067]大鼠末次灌胃五味子后，分别于0.5、1.5、5h采集大鼠血浆。样品中每个时间点的总质子化离子的叠加图为总离子色谱图。由于血浆样品成分复杂，木脂素含量相对较低，容易被掩盖，因此优先进行背景扣除(空白血浆)、基线校准、分子特征提取等步骤。在大鼠血浆中初步鉴定了13种木脂素和30种相应的代谢物,(吸收入血的木脂素l1-l13的化学结构和提取离子色谱图见图2-1、2-2)通过与参考化合物的比较，以及分析从文献和公共数据库中获得的分子式、碎片离子和化学结构信息进行鉴定。最后得出结论，木脂素的基线分离良好，并且在0.5小时、1.5小时和5小时血浆样品之间存在含量差异。所有鉴定结果列于表2中。[0068]表2-1大鼠血浆中吸收的木脂素类化合物的鉴定[0069][0070]从图2-1、2-2可以看出，l1-l13的木脂素类化合物具有相同的5,6,7,8-四氢二苯并环核心结构，但取代基位置不同。主要为甲基、甲氧基、亚甲二氧基、羟基和苯氧基取代基。在相同的碰撞诱导解离条件下，木脂素类化合物具有相似的碎片离子、洗脱行为较一致、相对强度和峰面积较为匹配。其中，甲基、甲氧基和水的中性碎片丢失是其主要的裂解途径。[0071]检测到的木脂素l7和l8的保留时间分别为6.5和6.9min。fbf推测的分子式为c30h32o9和c28h34o9，质量误差分别为0.5和7.0ppm，分别与自建数据库中的五味子酯甲和五味子酯乙化合物相对应。两者的准分子离子的m/z为559.194[m+na]+和537.210[m+na]+，含量均高于其[m+h]+。在ms/ms图谱中，两者均在415、437、385、371处具有高丰度m/z的碎片离子。根据碎片解释，m/z437和415离子分别对应于苯甲酸或2-甲基丁-2-烯酸基团从它们的质子化分子离子中丢失。m/z385和371处的产物离子分别为失去苯甲醛或(2z)-2-甲基丁-2-烯醛和二甲氧基从它们的质子化分子离子中丢失。五味子酯甲去除苯环形成m/z458处的独特产物离子，这有助于区分五味子酯甲和五味子酯乙。[0072]木脂素类化合物l1、l12和l13保留时间分别为：3.45、9.41和11.74min，其质荷比及推测结构式分别为：m/z 455.2040[m+na]+(推导式c24h32o7)、439.2091[m+na]+(推导式c24h2o)和423.1778[m+na]+(推导分子式c23h28o6)，与五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素ms/ms图谱相切合。它们核心八元环烯结构上均没有多余的取代基，因此，在碰撞诱导解离中主要丢失h2o(18da)、ch3(15da)、och3(31da)和ch2o(30da)等独立或组合的碎片峰。例如，五味子醇甲倾向于连续丢失一个或两个甲基形成m/z 440[m+na-ch3]+和m/z 425[m+na-2ch3]+的产物离子。在五味子甲素和五味子乙素中均倾向于失去-ch2o形成更稳定的带碳正离子的[m+na-ch2o]+特征离子(m/z分别为409、393)。并且，五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素易失去甲氧基和甲基形成[m+na-ch3-ch3o]+离子峰(m/z分别为409、393、377)。此外，五味子甲素和五味子乙素还易发生环辛烷开环形成[m+na-c10h14o3]+的特征离子(m/z分别为257、277)。[0073]综上所述，鉴定出13种吸收入血的木脂素类化合物，本研究中命名为l1-l13。[0074]2.2.2木脂素类入血成分的代谢图谱[0075]母体药物及其衍生代谢物在碰撞诱导解离下通常具有相似的核心结构和裂解模式。主要的i相反应包括脱烷基化、羟基化、氧化、水解和醌形成，ii相反应包括硫酸盐偶联、葡萄糖醛酸化、谷氨酰胺偶联等。本研究根据相关药物生物转化知识和母体药物的裂解模式最终确定了30种匹配度高的代谢物(包括未区分的异构体)，命名为m1-m30。其中，代谢物m1-m14、m15-m20、m21-m26、m27、m28-m30分别来自五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素，五味子乙素和五味子醇甲。图3-1、3-2、3-3详细阐明了这五种母体化合物的ms/ms碎裂、鉴定结果、及可能的代谢转化途径。[0076]总共鉴定出26种五味子酯甲的代谢产物(m1到m14，包括同分异构体)，在0.5、1.5h均能找到这26种不同含量的代谢产物，质量误差均小于5ppm。碎片解析表明：m1、m2、m4是通过单去甲基化产生；m9、m10是通过单羟基化产生；m3是通过去甲基化和羟基化组合产生；c7h4o丢失后、o-去甲基化则产生m5，葡萄糖醛酸化则产生m6；c7h6o丢失后、o-羟基化则产生m7，葡糖醛酸化则产生m8；羟基化后发生硫酸盐结合产生m11，o-脱甲基化后氧化则产生m12、m13、m14。26种代谢产物种，i相反应占大部分。一般来说，物质经过i相代谢通常会增加其极性，反相液相色谱系统中的rt时间更短。经过ii相代谢后，药物的毒性或活性降低，极性增加，更容易排出体外。此外，具有较大clog p值的化合物通常具有较长的保留时间。[0077]基于上述辅助标准，初步鉴定出准分子离子质荷比均为523.198的代谢产物m1和m2。化学结构式为c29h30o9，由于两种结构的clogp值不同(5.37和5.07)，保留时间分别为5.0和5.4min，(均在母体化合物五味子酯甲—6.5min之前洗脱出峰)。m1和m2的ms/ms图谱可见m/z505、491、487和479处的碎片离子。第一个碎片离子m/z505[m+h-h2o]丢失18da(-h2o)后产生m/z487的碎片离子，表明苯环上的甲氧基发生了去甲基化后紧接着会发生脱水。[0078]m9和m10均是五味子酯甲发生单羟基化，分别在3.7和3.3min洗脱出峰，准分子离子峰均为m/z 553.206，推测其化学结构式为c30h32o10。此外，它们在丢失苯甲酸基团后的碎片离子m/z415和437和五味子酯甲处相同，更加充分验证了推测结果的准确性。最后，通过它们clogp值差异(分别为5.38和4.47)较大，可推测m9为芳香族羟基化产物，而m10属于脂肪族羟基化产物。[0079]通过比较代谢物和母体化合物之间的色谱和质谱行为，检测到更多这样的代谢物，如m3-m8、m11-m14。表3列出了所有代谢物的分子式、质子化分子的准确质量、保留时间、推测的生物转化、ms/ms碎片和采样血浆的时间，图3-1展示了推测的五味子酯甲的代谢途径。[0080]五味子酯乙鉴定出15种代谢物(m15到m20，包括同分异构体)。单去甲基化则产生m15；去甲基化后，o-去甲基化则产生m16和m17；丢失c23h26o7葡萄糖醛酸化则产生m18；经氧化后产生m19；o-氧化和去甲基化产生m20，另外五味子酯乙丢失c5h6o和葡萄糖醛酸化后产生的m6与五味子酯甲中的代谢产物相同。五味子酯乙在大鼠灌胃给药后的0.5和1.5h血浆样品中含量均较高。其代谢产物保留时间介于2.51和5.87min之间(五味子酯乙在6.93min洗脱出峰)。图3-2描绘了推测的五味子酯乙的代谢途径。[0081]最后，在五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素中共鉴定出24种代谢产物(m21至m30)。保留时间在1.98至18.50min之间，其中23个的出峰时间在母体化合物之前。母体化合物被氧化形成m22；两次氧化形成m23；去甲基化形成m25和m28；去甲基化后与硫酸盐结合形成m26)、发生葡萄糖醛酸化则形成m30。[0082]具体来说，五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素在体内代谢均发生了相同的氧化和酮形成的生物转化(m21、m27和m29)，它们的[m+h]+准分子离子的m/z分别为431.206、415.175和447.201。较母体化合物[m+h]+准分子离子的m/z(417.227、401.195、433.222)均高了14da。m21的ms/ms图谱中主要碎片离子m/z为415、373、367；m27的为400、373、367，m29的为432、373、387。一般来说，脂肪族酮类化合物易失去c＝o基团发生α-裂解。m21、m27和m29三种代谢产物共有的6,7-二甲基二轮烯通过氧化和酮转化生成5,6-二甲基二轮烯。它们经羰基和甲氧基丢失后分别形成m/z 373、357、387的[m+h-c2h2o2]离子碎片。这也证实了它们都是苯并环烯酮结构。根据羟基化代谢物的典型质谱图分析可得出来自m27和m29的m/z为397和432的碎片是它们脱水的结果。m27由于亚甲二氧基丢失导致的特征性断裂形成m/z为367的离子碎片(与五味子乙素相比差44da)，推断m27是五味子乙素的代谢产物。[0083]m26的元素组成为c23h30o9s，洗脱时间为5.87min。在ms/ms图谱中可见m/z为403[m+h-o3s]+、385[m+h-ch2o4s]+、249[m+h-c8h10o6s]+和237[m+h-c9h10o6s]+的碎片离子)，其裂解规律由o3s、och3或ch3的单独或组合损失形成。其裂解规律由-o3s、-och3或-ch3的单独或组合损失形成，与五味子甲素的裂解规律类似，所以推测m26为五味子甲素去甲基化并硫酸盐化的代谢物。尽管在1-,3-或6-,8-和2-(7-)位置取代形成的三种化合物的clogp值有所不同，但在提取的色谱图中仅观察到一个主峰。因此，初步确定为m26a/b/c。[0084]表3-1 uplc-q-tof/ms鉴定的五味子在大鼠血浆中的代谢产物[0085][0086]2.3 swissadme预测的已鉴定木脂素类化合物及其代谢物的adme特性[0087]swissadme预测的评估结果如表4所示。药物相似性，是进一步评估被选为候选生物活性小分子的重要因素。包括5种母体化合物在内所有化合物中约86％的代谢物满足lipinski五法则(违背项数≤1)，表现出优异的药物相似性，符合良好的生物吸收(生物利用度评分≥0.55)。通过ilogp这项参数可以看出：与母体化合物相比，代谢物的亲脂性略有下降。患者通常会同时使用多种药物，此时药物之间代谢的相互影响将决定它们在体内安全性和有效性，所以有必要评估给予药物对代谢酶系的影响，如常用β-受体阻滞剂通过cyp2d6代谢。本研究中的65种代谢物(包括异构体)和5种母体化合物中，常见cyp1a2、cyp2c19、cyp2c9、cyp2d6和cyp3a4同工酶的酶抑制剂数分别为0、7、16、40、11。[0088]值得注意的是，其中8种化合物可以穿过血脑屏障，包括5种代谢物(m21、m22a/b、m27a/b)和3种母体化合物(五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲)。大约61％的代谢物只有高胃肠道吸收，这可以在boiled-egg模型中清楚地显示(图7)。白色区域为胃肠道被动吸收概率高，黄色区域为大脑穿透概率高。此外，约55％的代谢物(带蓝点的化合物)是p-gp底物，容易被细胞膜排出体外。[0089]表4-1 swissadme预测木脂素和代谢产物的adme性质[0090][0091][0092][0093][0094]2.4网络药理学分析[0095]2.4.1五味子的有效靶点[0096]通过网络药理学进一步分析本研究鉴定13种吸收成分和65种代谢物发现：其中50种化合物，包括11种吸收成分和39种代谢物在swiss target prediction中总共具有772个有效靶点。[0097]2.4.2 ppi网络分析[0098]在gene card和omim中检索与ipf相关的靶基因。利用venny 2.1软件将药物相关靶点与疾病相关靶点进行交叉，制作药物-疾病重叠靶点维恩图，在匹配的1100个重叠靶点中筛选，最后得出166个重叠靶点与疾病相关基因有关(图8a)[0099]将上述的166个药物-疾病重叠目标被引入到string中，构建出一个由166个节点和629个边组成的ppi网络。将该网络图导入cytoscape软件进行可视化分析(图8b)。数据显示adora2b和ptgir不与其他目标相互作用。选择前20个潜在靶点作为核心靶点(图8c)，mapk1、mapk3、rhoa、ep300、tnf和tgf-β1分别与32、29、25、21、18和17种蛋白质相关。这6个目标都与tgf-β信号通路有关。tgf-β信号通路是ipf的关键通路。因此，tgf-β信号通路将是该研究的重点。[0100]图8(a)五味子和ipf相关靶点的维恩图。(b)药物和疾病之间重叠靶标的蛋白质-蛋白质相互作用(ppi)网络，圆圈的大小代表相关程度。(c)药物与疾病重叠靶点的相邻节点数，x轴表示靶点相邻蛋白的数量，y轴表示不同靶点。[0101]2.4.3化合物-靶-疾病网络分析和潜在靶基因相关通路分析[0102]为阐明sch治疗ipf的潜在机制，采用cytoscape v3.7.1软件构建复合-靶点-疾病(ctd)网络，如图9所示，其中黄色节点代表五味子，绿色节点代表五味子的成分，紫色节点代表五味子和ipf之间的基因符号，红色节点代表ipf，边代表相互作用的目标。如图9所示，网络显示218个节点，包括50个化合物、166个靶基因、1个疾病(ipf)和1个tcm(五味子)，以及1509个化合物-靶标相互作用边缘。[0103]为了验证这些成分可以通过确定的作用途径调节靶点发挥治疗作用，进一步构建了潜在的靶基因相关途径网络。使用ctd网络中的87个核心目标基因进行kegg通路分析。包括20条通路(p《0.05)。确定了tgf-β信号通路、粘附连接、癌症中的microrna和其他17条与ipf相关的通路。通过对这20条信号通路的综合分析，发现与ipf最相关的是tgf-β通路。参与tgf-β信号通路的靶点有10个，包括tgf-β1、tgfbr1、tgfbr2、mapk3、mapk1、rhoa、ep300、rock1、rps6kb1、tnf。[0104]此外，还进行了功能富集分析。这些通路主要与肝脏保护(1个通路)、神经保护(2个通路)、抗癌(4个通路)、抗炎(3个通路)、抗原生动物(2个通路)、抗病毒(2条通路)和信号转导(7条通路)。分析结果与五味子的功能及其活性成分一致。另有部分相关的研究：五味子的活性成分具有保肝、抗肿瘤作用(jung et al.,2019；kortesoja et al.,2019；li et al.,2017；nasser等，2020)、抗炎(zhong等，2015)、抑菌、抗病毒、抗原生动物、免疫抑制、镇静和催眠以及神经细胞保护(barnes等，2012；chun等，2014a；jeong等人，2013年；wei等人，2019年)。[0105]化合物的均值度值(与之相关的靶点数)为15.37，44个化合物的匹配度大于15，说明这些化合物可能调控多个靶点发挥不同的治疗作用)。主要的tgf-β1信号通路靶向相关化合物是l1、l7、l8、l10、l12及其代谢物。值得注意的是，l1(匹配度＝35)、l7(匹配度＝28)、l8(匹配度＝32)、l10(匹配度＝36)、l12(匹配度＝34)、m21(匹配度＝29)、m25d(匹配度＝37),m26a(匹配度＝42),m26b(匹配度＝30),m26c(匹配度＝43)，由于它们在这个网络中的重要位置，可能是五味子中的关键化合物。可能对五味子的治疗效果起重要作用。[0106]2.5分子对接分析[0107]一般认为，当配体与受体结合能越低时，构象就越稳定，作用的可能性就越大。本研究中，五味子醇甲的代谢产物m21与核心靶蛋白tgfbr1结合能小于-5.0(-5.77)，氢键结合位点为lys-232和his-283，说明m21与核心目标具有更好的结合活性。展示了与靶蛋白结合最好的化合物(m21)对接结果(图4-1(a))，这与细胞验证实验的结果一致，表明五味子醇甲也具有良好的抗ipf作用。由这些数据可以看出，核心靶点和核心成分之间的相互作用是生物活性的基础。[0108]实施例2体外实验验证[0109]1方法[0110]1.1细胞培养[0111]用dulbecco改良eagle培养基(dmem，solarbio，北京，中国)，在10％胎牛血浆(fbs，浙江，中国)，37℃和5％co2条件下培养nih/3t3(atcc，crl-1658)。[0112]1.2实时定量聚合酶链反应[0113]使用trizol试剂(中国北京)提取总rna，然后用rnase-free dnase(promega，北京，中国)处理。按照逆转录试剂盒的说明在65℃5min，37℃60min，99℃5min，4℃5min的条件下使用mmlv(toyobo，上海，中国)、oligo-dt(中国北京)在pcr仪(applied biosystems,foster city,ca,usa)中进行进行反转录。引物由盛工生物技术有限公司(中国上海)委托，引物序列如下：[0114]α-sma：[0115]正向引物5'-tgctgacagaggcaccactgaa-3'(seq id no:1)，[0116]反向引物5'-cagttgtacgtccagaggcatag-3'(seq id no:2)[0117]e-钙粘蛋白：[0118]正向引物5'-ggtcatcagtgtgctcacctct-3'，(seq id no:3)[0119]反向引物5'-gctgttgtgctcaagccttcac-3'(seq id no:4)[0120]通过sybrtm green master mix(vazyme，北京，中国)在quantstudio 6 flex系统(applied biosystems，foster city，ca，usa)中进行实时定量聚合酶链反应(qrt-pcr)。qrt-pcr循环曲线如下：95℃3min和72℃10min1个循环，94℃、60℃和72℃30s35个循环。使用quantstudio 6 flex系统检测荧光信号。基因表达数据标准化为内源对照gapdh的数据。ct方法作为相对基因表达的基础。尼达尼布(纯度98％)作为阳性对照(元业生物科技有限公司，上海，中国)。[0121]1.3蛋白印迹试验[0122]测定全细胞裂解产物，α-sma(#19245)、e-cadherin(#3195)和beta-actin(#3700)的抗体购自cell signaling technology(danvers,ma,usa)。山羊抗兔抗体(#111-035-003)购自jackson immunoresearch inc(west grove,pa,usa)。[0123]2体外实验验证结果[0124]上皮-间质转化(emt)是ipf发病机制中的关键过程。qrt-pcr的实验结果表明，相比于空白组，五味子醇甲处理后的nih/3t3细胞中-sma的mrna显着降低(图4-1(b))、e-cadherin的mrna显着增加，且变化程度均较作为阳性对照的尼达尼布更为明显。western blot结果显示，经过五味子醇甲处理后，-sma显著降低，e-cadherin表达显著增加(图图4-1(c)、(d))。-sma的减少和e-cadherin的增加都促进了emt。以上数据表明，五味子醇甲的作用机制可能是其被细胞吸收转化为m21，然后m21通过与tgfbr1结合调节-sma和e-cadherin的表达来抑制emt。[0125]总的来说，体外实验研究为筛选具有潜在抗ipf作用的成分提供了额外的信息，增加了分子对接结果的合理性和基于系统药理学的筛选策略的可靠性。[0126]实施例3体内实验验证[0127]1方法[0128]1.1动物[0129]年龄为7-8周的c57bl/6雌性小鼠购自上海凌昌生物技术有限公司(中国上海)。所有小鼠均在我们的动物设施的标准条件下(光/暗循环12小时，温度22±1℃，湿度45–55％)，无特定病原体的环境下，自由获取食物和水。根据《实验动物护理和使用指南》，所有动物实验均由上海交通大学动物研究伦理委员会批准(许可证编号：a2018075)。[0130]1.2 blm诱导小鼠pf的建立[0131]博莱霉素(blm)诱导小鼠肺纤维化(pf)的实验如前所述进行。简言之，在适应性喂养一周后，将c57bl/6小鼠随机分为四组：(1)对照组；(2)blm(3)blm+五味子醇a(40mg/kg)组；(4)blm+五味子醇a(80mg/kg)组。在小鼠气管内单次滴注blm(1.6u/kg)诱导pf。对照组小鼠接受等量的生理盐水。blm治疗后第1天，blm+五味子醇a组小鼠灌胃五味子醇a(40mg/kg或80mg/kg)，而blm组小鼠灌胃等体积0.9％无菌生理盐水。3周后，处死小鼠，收集肺组织并进行测量。血清用于血清药理学检测。[0132]1.3羟脯氨酸测定[0133]使用羟脯氨酸试剂盒(beyotime biotechnology，中国上海)在550nm处通过吸光度法测定肺羟脯氨酸水平，结果以每毫克肺组织羟脯氨酸微克表示。[0134]1.4肺组织的组织学分析[0135]左肺用10％福尔马林固定24小时，石蜡包埋，切成5块m厚的部分。肺切片用masson三色染色法染色。通过垂直透射荧光显微镜收集图像，并在前面描述的image pro plus版本6.0中进行测试。[0136]2体内实验验证结果[0137]通过气管内注射blm建立小鼠pf，并从第1天到第21天每天给予不同剂量的五味子醇a。所有小鼠于第21天处死(图5a)。与nacl处理组相比，五味子醇a处理组体重减轻增加(图5b)。此外，五味子醇a可降低小鼠肺组织中羟脯氨酸水平(图5c)。随后，肺组织masson染色显示五味子醇a抑制胶原沉积(蓝色)(图5d)。这些数据表明，五味子醇a在体内可减弱blm诱导的胶原沉积。综上所述，五味子醇a可减轻blm诱导的小鼠肺纤维化。[0138]本发明对五味子的活性成分进行了探究，结果表明；五味子中的一些吸收入血的木脂素类化合物及其经过一次或者两次i相代谢后的产物是其抗ipf的物质基础。因为随着代谢的进行，体内每种母体化合物含量越来越少，且存在相互转化的可能性，而相应的代谢产物越来越多，更具有特异性。并且，药物经体内代谢后极性理应增大，以便于其排出体外，本发明的实验结果也与之相符。此外，研究中发现的五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲的ii相代谢产物分别仅有3、1、2、0、1种，表明ii代谢反应对其影响较小。而且它们在大于两种母体化合物中均存在，例如：c7h4o和葡萄糖醛酸化代谢物的丢失(m6，出现在五味子酯甲和五味子酯乙代谢谱中)；氧化和葡萄糖醛酸化代谢物(m24，rt＝8.28分钟，在五味子甲素和五味子醇甲代谢谱中均存在)；以及通过去甲基化和葡萄糖醛酸化产生的代谢物(m30)。因此本研究并为选其作为分析目标。[0139]因此，本研究选取的分析目标为：五味子酯甲的去甲基代产物m2和丢失c7h6o并羟基化代谢物m9；五味子酯乙的去甲基代谢产物m15；五味子甲素的代谢产物m21；五味子乙素的代谢产物m27；五味子醇甲的代谢产物m29。此外，对于有多种母体化合物的代谢产物来说，其丰度不仅受不同基因型的代谢酶影响，还受其母体化合物的影响。[0140]ctd网络分析表明，五味子醇甲及其代谢产物m21为核心成分，其靶标为tgf信号通路中的核心蛋白；分子对接结果显示m21与tgfbr1结合能小于-5。细胞实验结果表明，五味子醇甲具有抑制emt的作用，体内、外实验结果一致。因此，我们推测五味子醇甲在细胞内的活性代谢物m21，m21通过与tgfbr1结合影响tgf信号通路，从而通过调节的-sma和e-cadherin抑制emt在纤维化治疗中发挥作用。值得注意的是，以往大部分是关于五味子乙素和五味子醇甲抗纤维化作用的研究，但本发明基于血清药化学的综合分析表明，五味子醇甲可以直接作用于tgf-β信号通路，也指出了中药的多成分、多靶点、多渠道机制。与以往的研究相比，本研究的亮点在于对吸收成分的综合分析：首次报道了五味子醇甲的tgf-β信号通路抑制机制。另外，在后续的研究中，我们将基于血清药化学和血清药理学研究五味子醇甲抗ipf作用的详细机制，包括细胞内代谢物m21的含量。通过动物实验验证m21通过抑制二聚化作用影响tgf信号通路tgfbr1或通过抑制tgf-和tgfbr1来产生抗ipf作用。[0141]综上所述，本研究基于血清药化学的基础上探究了木脂素的生物转化和药理活性。首次通过网络药理学建立了m21抗ipf的网络关系，表明五味子醇甲及其氧化-酮形成代谢物m21主要通过调节tgf-β信号通路发挥抗纤维化作用。分子对接分析和体外实验证实了m21可以通过与tgfbr1结合调节-sma和e-cadherin的表达来影响emt。结果表明，五味子醇甲的代谢物m21比其他化合物具有更好的抗ipf活性。为了解五味子的生物活性化合物及药理机制提供了理论支持。我们将对上述实验做进一步探究。[0142]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。