1 岁前起病的良性家族性癫痫基因突变谱研究

　　1 岁前起病的良性家族性癫痫是一种常染色体显性遗传的癫痫，以新生儿或婴儿期起病且无诱因的局灶性发作或局灶性发作继发全面性发作为特征，多在早期缓解，预后良好[, ]。所有的患儿均有早期起病癫痫家族史。1 岁前起病的良性家族性癫痫可根据起病年龄划分为 3 个癫痫综合征：良性家族性新生儿癫痫 Benign familial neonatal epilepsy，BFNE）、良性家族性新生儿-婴儿癫痫（Benign familial neonatal-infantile epilepsy，BFNIE）和良性家族性婴儿癫痫（Benign familial infantile epilepsy，BFIE）。BFNE 在新生儿期起病，且大多在生后 5d 内起病[]。BFNIE 多在生后 2d～3.5 个月起病[]。BFIE 在婴儿期起病，生后 4～7 个月为高峰起病年龄[]。在儿童期或青少年期，BFIE 家系中的部分成员可出现阵发性运动诱发的运动障碍（Paroxysmal kinesigenic dyskinesias，PKD），这种 BFIE 的临床亚型被称为婴儿惊厥伴阵发性舞蹈手足徐动症（Infantile convulsions with paroxysmal choreoathetosis syndrome，ICCA）[]。

　　1998 年发现，编码电压门控钾离子通道的 KCNQ2 基因和 KCNQ3 基因是 BFNE 的主要致病基因[, ]，近年来发现编码电压门控钠离子通道的 SCN2A 基因也可以导致 BFNE 表型[]。2002 年国外文献报道，SCN2A 基因是 BFNIE 的主要致病基因[, ]，近年来发现 KCNQ2 基因也是 BFNIE 的致病基因。2011 年，我国学者 Chen[]采用全外显子组测序的方法，首次在国际上发现编码富脯氨酸跨膜蛋白 2 的 PRRT2 基因是 PKD 的致病基因。2012 年 Heron 等[]发现 PRRT2 基因突变也见于 BFIE 和 ICCA 家系，且在这些家系中的突变检出率高。少数 BFIE 家系可由 KCNQ2、KCNQ3 和 SCN2A 基因突变导致[]。然而，文献报道仍有部分 BFNE、BFNIE 和 BFIE 家系尚未明确致病基因。目前我国尚无大样本的家系研究对 1 岁前起病的良性家族性癫痫进行系统的基因突变分析。因此，本研究对我国 1 岁前起病的良性家族性癫痫进行基因突变分析，探讨其致病基因谱。

　　收集自 2006 年 9 月–2018 年 1 月在北京大学第一医院就诊且至少有 2 个家系成员在 1 岁前出现局灶性癫痫发作的家系。本研究已获得北京大学第一医院伦理委员会的批准。所有患者及家系成员均签署知情同意书。通过问卷收集患者及其亲属的临床资料包括起病年龄、发作类型、既往史、智力运动发育情况、用药史、家族史及辅助检查结果等，随后通过门诊或电话进行随访。

　　良性家族性癫痫的诊断标准如下[, ]： ① 起病年龄在 1 岁前；② 无诱因的局灶性发作或局灶性发作继发全面性发作，多有丛集性发作（即 24 h 内发作≥2 次）特点；③ 脑电图（EEG）背景正常，发作期可为局灶起源的痫样放电，发作间期无典型痫样放电；④ 头颅影像学检查无异常；⑤ 排除了低血钙、低血糖等代谢紊乱导致的惊厥；⑥ 起病前后智力运动发育正常；⑦ 有良性新生儿或婴儿癫痫家族史；⑧ 发作呈自限性或对抗癫痫药物（AEDs）反应好，且大多数在 2 岁前癫痫发作缓解。

　　从出生至生后 28 d 定义为新生儿期，生后 28 d～1 岁定义为婴儿期。所有受累者均在新生儿期起病的家系诊断为 BFNE。所有受累者均在生后 28 d～3 个月起病或者同时有新生儿期和婴儿期起病受累者的家系诊断为 BFNIE。所有受累者都表现为婴儿期起病的癫痫且其中大部分受累者在 3 月龄后起病的家系诊断为 BFIE。有家系成员出现 PKD 表现的家系会被进一步诊断为 ICCA。

　　收集先证者及其家系成员的外周血，并采用 Miller 改良盐析法提取外周血白细胞基因组 DNA。

　　采用 PCR 扩增和 Sanger 测序对先证者的 PRRT2 基因进行突变筛查。PCR 引物序列及反应条件同本课题组之前的研究[]。如发现先证者 PRRT2 编码区变异，进一步对其他成员进行相应片段的 PCR 扩增和测序，然后在家系中进行共分离分析。

　　对 BFNE 家系、BFNIE 家系以及 PRRT2 基因 Sanger 测序阴性的 BFIE 家系先证者，进一步采用靶向捕获二代测序癫痫基因检测包进行基因突变筛查。该癫痫基因检测包包含 149 个癫痫相关致病基因 （北京迈基诺医学检验所）。对二代测序发现的可能致病的变异或拷贝数变异（Copy number variations，CNVs），进一步采用 Sanger 测序、多重链接依赖的探针扩增方法（Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）或者实时荧光定量 PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）进行验证。对其他家系成员，仅对可能致病的变异或 CNVs 进行检测，然后在家系中进行共分离分析。对于未报道过的新突变，则对 104 名正常对照者 DNA 进行该突变的检测。在家系中与家系成员表型共分离且符合家系遗传模式的变异或 CNVs 即被认为是致病突变。

　　共收集了 89 个 1 岁前起病的良性家族性癫痫家系，有 295 例家系成员受累，每个家系存在 2～19 例受累者（平均 3.3 例）。有 4 个家系存在起病年龄超过 1 岁的受累者（家系 37，47，58，80）。这 4 个家系中，最晚的起病年龄分别为 13 个月、3 岁、14 个月和 2 岁。89 个家系中有 4 个 BFNE 家系，7 个 BFNIE 家系和 78 个 BFIE 家系，其中 18 个 BFIE 家系被进一步诊断为 ICCA 家系。89 个家系中，68 个家系检测出基因突变（68/89，76.4%），其中 50 个家系发现 PRRT2 基因突变（50/89，56.2%），9 个家系发现 KCNQ2 基因突变（9/89，10.1%），8 个家系发现 SCN2A 基因突变（8/89，9.0%），1 个家系发现 GABRA6 基因突变（1/89，1.1%）。21 个家系未发现致病基因（21/89，23.6%）。89 个家系的临床特点及基因突变分析结果见。

　　在 4 个 BFNE 家系中，有 3 个家系发现 KCNQ2 突变，其余 1 个家系（家系 4）未发现致病基因。家系 4 有 2 例受累者。该家系先证者在生后 1d 开始出现癫痫发作，出生后 3 个月口服苯巴比妥和左乙拉西坦发作控制，之后停用苯巴比妥，继续口服左乙拉西坦至 2 岁 6 个月停药，3 岁 10 个月睡眠中又出现了 2 次抽搐发作，EEG 显示为 Rolandic 区放电，考虑癫痫发作演变为伴中央颞区棘波的儿童良性癫痫（Benign epilepsy with centro-temporal spikes，BECTS），给予口服左乙拉西坦治疗后未再发作，末次随访年龄为 4 岁 3 个月，已 5 个月无癫痫发作，智力运动发育正常。先证者的父亲生后 2 d 开始出现无热抽搐，发作呈丛集性，最多 24 h 内发作可达 4～5 次，末次发作为 3～4 岁，一直未用药治疗，从小智力运动发育正常。4 个 BFNE 家系的家系图见。

　　7 个 BFNIE 家系均检测出基因突变，其中 PRRT2 突变 1 个家系，KCNQ2 突变和 SCN2A 突变各 3 个家系 。7 个 BNFIE 家系的家系图见。家系 6 携带 1 个已报道的 KCNQ2 突变 c.998G>A/p.R333Q。该家系共有 8 例受累者，其中 7 例受累者在生后 2 d～6 个月开始出现癫痫发作，均在 1 岁前缓解，智力运动发育正常。该家系先证者在生后 2 d 开始出现癫痫发作，表现为难治性癫痫，3 岁时 EEG 提示出现了睡眠中癫痫性电持续状态（Electrical status epilepticus in slow waves sleep，ESES），使用多种抗癫痫药物治疗无效，并出现了严重的智力运动发育落后，诊断为早发癫痫性脑病，在 8 岁 1 个月时发作自行缓解。该患儿携带KCNQ2 突变 R333Q，该突变遗传自其父亲。患儿父亲表型为良性新生儿癫痫，智力运动发育正常。家系 7 有 2 例受累者，智力运动发育均正常。二代测序发现家系 7 的先证者存在 KCNQ2 基因杂合片段缺失，该片段缺失还累及了邻近的 CHRNA4 基因。采用 MLPA 验证发现，该缺失范围包含 KCNQ2 基因和 CHRNA4 基因的全部外显子。MLPA 检测发现先证者之父也存在与先证者相同的 KCNQ2 和 CHRNA4 基因片段缺失，先证者之母、先证者之祖父和先证者之祖母未携带相同突变。

　　在 78 个 BFIE 家系中，有 58 个家系检测出基因突变（58/78，74.4%），其中 PRRT2 基因突变 49 个（49/78，62.8%），SCN2A 基因突变 5 个，KCNQ2 基因突变 3 个，GABRA6 基因突变 1 个，其余 20 个家系未发现致病基因。在 78 个 BFIE 家系中，有 18 个家系可进一步诊断为 ICCA，其中 17 个发现 PRRT2 基因突变（17/18，94.4%），其余 1 个家系未发现致病基因。78 个 BFIE 家系图见。

　　本研究在 50 个携带 PRRT2 突变的家系中共发现 14 种不同的 PRRT2 突变，其中包括移码突变 8 种、无义突变 3 种、错义突变 1 种、终止密码子突变 1 种和基因片段缺失 1 种。家系 30（BFIE 家系）的先证者行 PRRT2 基因 Sanger 测序未发现突变，随后二代测序分析发现 PRRT2 杂合基因片段缺失，缺失的位置位于 chr16: 29824376-29825959，缺失的长度约为 1583bp。先证者及其母携带相同突变（起病年龄和发作表现与先证者相似），先证者外祖母未携带相同突变，未获得先证者之父 DNA。本研究有 32 个家系携带 PRRT2 基因热点突变 c.649dupC/p.R217PfsX8，占所有 PRRT2 突变阳性家系的 64.0%（32/50）；6 个家系携带热点突变 c.649delC/p.R217EfsX12，占所有 PRRT2 突变阳性家系的 12.0%（6/50）。本研究发现 5 种尚未见报道的 PRRT2 突变（c.560dupT/p.Q188AfsX4、c.679C>T/p.R227X、c.649dupCC/p.R217PfsX13、c.294delC/p.C99AfsX16、c.913G>T/p.G305W）。家系 50 为 ICCA 家系，该家系的先证者携带一个PRRT2 基因复合杂合突变，其中一个杂合突变 c.649dupC/p.R217PfsX8 遗传自其患 PKD 的父亲，另一个杂合突变 c.593_594delCT/p.P198RfsX26 遗传自无症状的母亲。家系 50 先证者服用丙戊酸至 2 岁停药，停药后癫痫复发，之后开始口服卡马西平治疗，末次随访时该患儿为 2 岁 4 个月，已控制 4 个月无发作，运动发育正常，语言表达稍落后于同龄儿童。

　　本研究共发现 9 个 1 岁前起病的良性家族性癫痫家系携带 KCNQ2 突变，其中 BFNE、BFNIE 和 BFIE 各 3 个家系。9 个家系携带 9 种不同的 KCNQ2 突变，其中包括无义突变 1 种、错义突变 7 种和基因片段缺失 1 种。6 种 KCNQ2 突变为未报道的新突变（c.1048A>C/p.N350H、c.242T>C/p.L81P、c.2506G>T/p.E836X、c.958G>A/p.V320I、c.237T>G/p.N79K 和 c.1510C>T/p.R504W）。

　　本研究共发现 8 个家系携带 SCN2A 突变，其中 BFNIE 家系 3 个，BFIE 家系 5 个。8 个家系携带 8 种不同的 SCN2A 错义突变，其中 6 种为未报道的新突变（c.2627A>G/p.N876S 、c.2872A>G/p.M958V、c.752T>C/p.V251A、c.1307T>C/p.L436S、c.4835C>G/p.A1612G 和 c.1737C>G/p.S579R）。

　　本研究发现 1 个 BFIE 家系 （家系 61） 携带未报道的 GABRA6 基因突变 c.523G>T /p.G175W。该家系先证者及其母在生后 8.5 个月～9 个月开始出现癫痫发作，且均在 1 岁前发作控制，智力运动发育正常（先证者的末次随访年龄为 5 岁）。先证者的外祖母也携带相同突变，是否有癫痫史不详。本研究发现的GABRA6 基因氨基酸位点 G175 高度保守。该突变在人类基因突变数据库（HGMD）、外显子组整合联合数据库（ExAC）和千人基因组数据库（1 000G）中均未见报道。该突变在 104 名中国正常对照人群中未发现。

　　本研究 KCNQ2 基因突变可见于 BFNE、BFNIE 和 BFIE 家系，在这三种家系中的检出率分别为 75.0%（3/4）、42.9%（3/7）和 3.8%（3/78），其中在 BFNE 家系中的检出率最高。SCN2A 基因突变可见于 BFNIE 和 BFIE 家系，在这两种家系中的检出率分别为 42.9%（3/7）和 6.4%（5/78），其中在 BFNIE 家系中的检出率最高（3/7，42.9%）。PRRT2 突变可见于 BFNIE 和 BFIE 家系，在这两种家系中的检出率分别为 14.3%（1/7）和 62.8%（49/78），其中在 BFIE 家系的检出率最高。本研究仅发现 1 个 BFIE 家系携带 GABRA6 基因突变（1/78，1.2%）。PRRT2、KCNQ2、SCN2A 和 GABRA6 基因突变家系的在 BFNE、BFNIE 和 BFIE 家系中所占的比例见。

　　本研究结果显示，在 89 个家系中，总体的突变检出率为 76.4%。这一结果略低于 Zara 等[]的结果，其结果显示总体的突变检出率为 89%，相关的致病基因包括 PRRT2、KCNQ2、SCN2A 和 KCNQ3基因。本研究 1 岁前起病的良性家族性癫痫相关的基因包括 PRRT2、KCNQ2、SCN2A 和 GABRA6。

　　在本研究 4 个 BFNE 家系中，有 3 个家系检测出 KCNQ2 基因突变。KCNQ2 基因是本研究中唯一与 BFNE 相关的基因。这也表明 KCNQ2 基因是我国 BFNE 家系的主要致病基因。尽管本研究中 BFNE 家系样本量较小，这个结果与 Zara 等[]和 Grinton 等[]报道的结果是一致的。Zara 等[]在 8 个 BFNE 家系中发现 7 个家系携带 KCNQ2 基因突变。Grinton 等[]发现约 80% BFNE 家系携带 KCNQ2 突变。Grinton 等[]的研究还发现少数 BFNE 家系携带 KCNQ3 突变和 SCN2A 突变。然而，本研究 BFNE 家系中未发现有 KCNQ3 和 SCN2A 突变。这表明，KCNQ3 和 SCN2A 可能是 BFNE 的少见致病基因。

　　本研究中的 7 个 BFNIE 家系均检测出致病突变，相关基因有 KCNQ2、SCN2A 和 PRRT2 基因。文献报道，SCN2A 基因是 BFNIE 的主要致病基因[, ]。既往文献也报道，KCNQ2 基因是 BFNIE 的致病基因[, ]。本研究发现了 SCN2A 突变和 KCNQ2 突变各见于 3 个 BFNIE 家系（3/7，42.9%），这表明 SCN2A 基因和 KCNQ2 基因均是我国 BFNIE 的重要致病基因。本研究发现 1 个典型的 BFNIE 家系为 KCNQ2 和 CHRNA4 基因片段缺失（家系 7）。CHRNA4 基因点突变已报道与常染色体显性遗传的夜间额叶癫痫相关[]。既往 Kurahashi 等[]已报道，累及 KCNQ2 基因及与其相邻的 CHRNA4 基因的片段缺失可以导致典型的 BFNE，所有的受累者均无 CHRNA4 基因突变相关 ADNFLE 表型。但随后 Pascual 等[]报道，累及 KCNQ2 基因及与其相邻的 CHRNA4 基因的片段缺失也可以导致新生儿期起病的癫痫伴发育落后。本研究家系 7 中的 2 例受累者均表现为新生儿或婴儿期起病良性癫痫，无智力运动发育落后和常染色体显性遗传的夜间额叶癫痫表现。文献报道，PRRT2 突变导致的癫痫起病年龄可早至生后数天[, ]。本研究发现一个 BFNIE 家系携带 PRRT2 基因突变 c.649dupC，该家系中两例受累者的起病年龄为生后 2～2.5 个月，说明 PRRT2 基因也是少数 BFNIE 家系的致病基因，但本研究未发现有 PRRT2 突变家系存在新生儿期起病受累者。

　　在本研究 1 岁前起病的良性家族性癫痫综合征中，BFIE 家系是遗传异质性最显著的，相关的基因有 PRRT2、KCNQ2、SCN2A 和 GABRA6。本研究中 BFIE 家系基因突变的阳性率为 74.4%（58/78）。在所有的 BFIE 家系中，PRRT2 基因突变最常见，占所有 BFIE 家系的 62.8% （49/78），与国际上报道的比例大致接近[, , , ]。本研究中，PRRT2 突变大多为移码突变，其他少见的基因突变类型有无义突变、终止密码子突变、片段缺失和错义突变。文献报道，PRRT2 存在热点突变 c.649dupC[, ]，该突变占本研究中 PRRT2 突变家系的 64.0%（32/50）。本研究发现 PRRT2 突变 c.649delC 也较常见，占本研究中 PRRT2 突变家系的 12.0%（6/50）。本研究有 18 个家系有成员出现 PKD 表型，可进一步诊断为 ICCA 家系。在这些家系中仅检测出 PRRT2 突变，且 PRRT2 基因突变的检出率极高，占所有 ICCA 家系的 94.4%，与国外文献报道一致[, -]，说明有家系成员出现 PKD 表型的 BFIE 家系的 PRRT2 基因检出率较无家系成员出现 PKD 表型的 BFIE 家系更高。既往文献报道，PRRT2 基因突变导致的良性癫痫患者的起病年龄最晚可为 28 月龄[]。本研究中有 4 个 BFIE 家系存在 1 岁后起病的受累者，受累者最晚起病年龄为 3 岁，其中有 3 个家系发现 PRRT2 或 SCN2A 基因突变。本研究中有 20 个 BFIE 家系仍未发现致病基因，其中受累者最多的家系有 5 例受累者。对于这些家系，必要时可进一步行全外显子组测序寻找致病基因。

　　KCNQ2 基因是本研究中唯一与三种 1 岁前起病的良性家族性癫痫综合征均相关的基因，在三种癫痫综合征家系中所占的比例分别为 75.0%（3/4）、42.9%（3/7）和 3.8%（3/78），由此可见，在 1 岁前起病的良性家族性癫痫家系中，随着起病年龄的增长，KCNQ2 基因突变检出率逐渐减低，说明大多 KCNQ2 基因突变导致的癫痫起病较早。既往文献报道，KCNQ2 基因突变不但可以导致良性癫痫，还可以导致癫痫性脑病[]。KCNQ2 基因相关的癫痫表型存在异质性，即使在同一个家系中，携带相同突变的受累者表型也可轻重不一[-]。本研究在 1 个 BFNIE 家系（家系 6）中发现 7 例受累者为新生儿期或婴儿期起病的良性癫痫，其余 1 例受累者表现为早发癫痫性脑病。该受累者携带父源的 KCNQ2 突变 R333Q，其父亲表型为良性新生儿癫痫。KCNQ2 突变 R333Q 已报道与 BFNE 相关[]，本研究进一步证明即使携带相同 KCNQ2 突变，受累者的表型也可存在明显差异。

　　本研究发现 8 个 1 岁前起病的良性家族性癫痫家系携带 SCN2A 突变，其中 6 种突变尚未见文献报道，拓展了 SCN2A 的突变位点谱。文献报道，SCN2A 基因是 BFNIE 的主要致病基因[, ]。本研究发现 42.9%（3/7）的 BFNIE 家系为 SCN2A 突变所致，但仅 6.4%（5/78）BFIE 家系携带 SCN2A 突变，说明 SCN2A 突变在 BFNIE 家系中更常见。文献报道，SCN2A 基因也是 BFNE 的致病基因[]，但是本研究未发现有 BFNE 家系携带 SCN2A 突变。

　　Labate 等[]学者已报道，PRRT2 基因纯合突变可导致婴儿期起病的癫痫伴智力低下。本研究 1 个 BFIE 家系（家系 50）的先证者携带 PRRT2 基因复合杂合突变。该患儿无典型癫痫性脑病表现，但与家系中其他仅携带一个杂合 c.649dupC 突变的受累者相比，该患儿对抗癫痫药物更具依赖性，且语言发育也较同龄儿稍落后。这表明与 PRRT2 基因杂合突变相比，PRRT2 复合杂合突变可能会导致更严重的表型。

　　本研究在 1 个 BFIE 家系（家系 61）发现了一个未报道的 GABRA6 突变 c.523G>T/p.G175W。GABRA6 基因是杂聚肽五聚体配体门控离子通道 γ-氨基丁酸（GABA）-A 受体基因家族的一员，哺乳动物大脑中主要的抑制性神经递质 GABA 需通过其起作用。既往文献报道，GABRA6 基因突变与儿童失神癫痫相关，此外，该基因上的多态性改变可增加特发性癫痫的易感性[, ]，但目前国际上报道的与癫痫相关的 GABRA6 突变仍较少。本研究首次在 BFIE 家系中发现了 GABRA6 突变，生物信息学分析和家系共分离分析均支持 c.523G>T/p.G175W 为该家系的致病突变，但仍需进一步的功能研究，将此基因突变与 BFIE 表型联系起来。

　　本研究有 1 个 BFNE 家系（家系 4）未发现致病基因，该家系先证者在生后 1 d 起病，生后 3 个月服苯巴比妥和左乙拉西坦发作控制，3 岁 10 个月睡眠中又出现了 2 次发作，复查 EEG 显示 Rolandic 区放电，提示演变为 BECTS。先证者的父亲在出生后 2 d 开始出现癫痫发作，末次发作为 3～4 岁。与本研究中 3 个 KCNQ2 突变的 BFNE 家系受累者相比，该家系 2 例受累者的末次发作年龄偏大，但智力运动发育均正常。既往文献报道少数 BFNE 患者后期可出现其他类型的癫痫。文献报道 1 例 BFNE 患者在 3 岁发展为 BECTS，对卡马西平治疗反应好，末次随访年龄为 12 岁，发作已缓解且已停药，智力运动发育正常，该患者携带 KCNQ3 基因片段缺失[]。Zara 等[]报道了 1 个有 10 例受累者的 BFNE 大家系，该家系大多数受累者在出生后 2 d 出现癫痫发作，出生后 22 d 前缓解。然而，该家系有 1 例受累者在 17 岁又出现了颞叶癫痫；另有 1 例受累者 6 岁出现难治性癫痫，52 岁时头颅磁共振显示右侧海马萎缩。

　　新生儿期或婴儿期的良性家族性癫痫是 1 岁前起病的常见癫痫，患者的癫痫发作多呈自限性或对 AEDs 敏感且不遗留任何神经系统后遗症。早期明确病因对指导家庭遗传咨询及治疗具有重要作用。KCNQ2、SCN2A 和 PRRT2 是 1 岁前起病的良性家族性癫痫的主要致病基因。KCNQ2 是 BFNE 的主要致病基因，PRRT2 是 BFIE 的主要致病基因，KCNQ2 和 SCN2A 基因突变在 BFNIE 中常见。GABRA6 可能是 BFIE 新发现的致病基因，需进一步的功能研究证实。